タンパク質におけるジスルフィド結合ペアの割り当てのための新しい方法論

既知の配列のタンパク質におけるジスルフィド結合の割り当てのための新しい方法論が説明されています。変性タンパク質は、pH 3.0クエン酸緩衝液中のトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）による限られた還元にさらされ、部分的に還元されたタンパク質異性体の混合物を生成します。新生のスルフヒドリルは、同じ緩衝条件下で1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロ酸（CDAP）によってすぐにシアン化されます。逆相HPLCによって分離され、収集されたシアン化タンパク質異性体は、水性アンモニアのシアン酸システインのN末端にペプチド結合の切断にさらされ、残留ジスルフィド結合によってまだ関連する切り捨てられたペプチドを形成します。残りのジスルフィド結合は完全に還元されて、MALDI-MSによってマスマッピングできるペプチドの混合物を与えます。得られたペプチド断片の腫瘤は、減少、シアニル化、および切断を受けたペアのシステインの位置に関連しています。副反応、ベータ除去は、しばしば切断に伴い、割り当ての補完的な確認を提供する重なり合ったペプチドを生成します。この戦略は、ジスルフィド結合のスクランブルを最小限に抑え、シンプルで高速で、敏感です。新しいアプローチの実現可能性は、隣接するシステインを含むさまざまなジスルフィド結合結合を含むモデルタンパク質の分析で実証されています。実験条件は、タンパク質の部分還元、スルフヒドリルシアン化、および化学切断反応のために最適化されています。

A novel methodology is described for the assignment of disulfide bonds in proteins of known sequence. The denatured protein is subjected to limited reduction by tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) in pH 3.0 citrate buffer to produce a mixture of partially reduced protein isomers; the nascent sulfhydryls are immediately cyanylated by 1-cyano-4-dimethylamino-pyridinium tetrafluoroborate (CDAP) under the same buffered conditions. The cyanylated protein isomers, separated by and collected from reversed-phase HPLC, are subjected to cleavage of the peptide bonds on the N-terminal side of cyanylated cysteines in aqueous ammonia to form truncated peptides that are still linked by residual disulfide bonds. The remaining disulfide bonds are then completely reduced to give a mixture of peptides that can be mass mapped by MALDI-MS. The masses of the resulting peptide fragments are related to the location of the paired cysteines that had undergone reduction, cyanylation, and cleavage. A side reaction, beta-elimination, often accompanies cleavage and produces overlapped peptides that provide complementary confirmation for the assignment. This strategy minimizes disulfide bond scrambling and is simple, fast, and sensitive. The feasibility of the new approach is demonstrated in the analysis of model proteins that contain various disulfide bond linkages, including adjacent cysteines. Experimental conditions are optimized for protein partial reduction, sulfhydryl cyanylation, and chemical cleavage reactions.