バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼによる転写開始の速度論的メカニズム

バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼによる転写開始の速度論的メカニズムを、過渡状態の運動法を使用して調査しました。バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼによる転写は、開始、プロモータークリアランス、および伸長からなる3つの段階で発生します。最大6〜8-MERの中絶製品は、開始段階で合成されました。開始から伸長への移行は、6-8-MERと11-12-MERの合成の間に発生し、12MER RNAの合成後に処理伸長期が始まりました。我々の結果は、PHI 10プロモーターからの伸長生成物の合成が、開始の効率とポリメラーゼがプロモーターから逃げる頻度の両方によって制限されていることを示しています。ヘパリントラップを用いた研究は、ポリメラーゼが中絶RNA合成の複数のターンオーバー中にプロモーター領域との接触を維持することを示唆しています。したがって、ポリメラーゼは、中絶RNA合成の各イベントの後、プロモーターから完全に解離しません。RNA合成の前の定常状態の速度論は、RNA合成の定常状態速度定数（0.1 s（-1））の約30倍高速である速度定数（3.5 s（-1））で開始が発生することを示しています。。RNA合成の定常状態速度定数は、主にRNAポリメラーゼのサイクリングによって制限されていますが、開始は最初のRNA産物であるPPPGPGの形成によって制限されます。PPPGPGの合成は、GTP結合、DNA結合、またはプロモーターDNAの融解に関連するステップによって制限されないことを示しています。代わりに、運動の結果は、PHI10プロモーターでの開始が最初のホスホジエステル結合形成ステップによって制限されているか、PPPGPG形成前の立体構造の変化によって制限されていることを示しています。このような立体構造の変化は、効率的なホスホジエステル結合形成のための開始および伸長NTPの適切なアラインメントと、RNA合成の忠実度を維持することに役割を果たす可能性があります。

The kinetic mechanism of transcription initiation by bacteriophage T7 RNA polymerase was investigated using transient state kinetic methods. Transcription by bacteriophage T7 RNA polymerase occurs in three stages consisting of initiation, promoter clearance, and elongation. Abortive products, up to 6-8-mer, were synthesized during the initiation phase; the transition from initiation to elongation occurred between the synthesis of 6-8-mer and 11-12-mer, and the processive elongation phase began after the synthesis of 12-mer RNA. Our results show that the synthesis of elongation product from the phi 10 promoter is limited both by the efficiency of initiation and by the frequency at which the polymerase escapes the promoter. Studies with heparin trap suggest that the polymerase maintains contact with the promoter region during multiple turnovers of abortive RNA synthesis; thus, the polymerase does not completely dissociate from the promoter after each event of abortive RNA synthesis. The pre-steady-state kinetics of RNA synthesis indicate that initiation occurs at a rate constant (3.5 s(-1)) that is about 30 times faster than the steady-state rate constant of RNA synthesis (0.1 s(-1)). The steady-state rate constant of RNA synthesis is limited largely by the cycling of the RNA polymerase, whereas initiation is limited by the formation of pppGpG, the first RNA product. We show that the synthesis of pppGpG is not limited by steps associated with GTP binding, DNA binding, or the melting of the promoter DNA. Instead, the kinetic results indicate that initiation at the phi10 promoter is limited either by the first phosphodiester bond formation step or more likely by a conformational change prior to pppGpG formation. Such a conformational change could play a role in proper alignment of the initiating and elongating NTPs for efficient phosphodiester bond formation and in maintaining the fidelity of RNA synthesis.