脊椎動物の核タンパク質輸入に関与するインポートアルファ/ベータヘテロダイマーとタンパク質との間の分子相互作用

in vitro結合アッセイを使用して、脊椎動物の核タンパク質輸入に関与する多数の細胞質および核間孔タンパク質の間の特定の相互作用を調べました。核輸送因子2（NTF2）、ヌクレオポリンP62、およびRAS様GTPaseがベータサブユニットを介してインポートヘテロダイマーに結合したことを実証します。p62切り捨て変異体の結合挙動は、インコピン・ベータが主にヌクレオポリンp62のアルファヘリカルコイルドコイルロッドドメインと相互作用し、XFXFG配列Motifに基づく多くの縮退反復を含むN末端ドメインとは相互作用しないことを示しました。ranのインポートベータへの結合は、そのヌクレオチド状態に敏感であり、RangTP結合は強くなりましたが、RANGDP結合はアッセイ条件を使用して検出できませんでした。RangDPではなくrangtpは、インポートアルファ/ベータ錯体に結合したp62を置き換えることができ、ポントンベータオーバーラップ上のp62およびrangtpの結合部位が示唆されました。さらに、RangDPではなくRangtpは、濃度依存的にインポートアルファとインポートベータの相互作用を弱めました。NTF2はインポートヘテロダイマーに結合しましたが、P62を変位させず、インポートベータのNTF2およびP62結合部位が重複しないことを示唆しています。私たちが観察した一連の相互作用は、転写因子IIIAなどのNLS含有基質のインポートヘテロダイマーへの結合によって変更されませんでした。我々の結果は、核核孔複合体を介した転座中に、RANヌクレオチド交換がインポーチン層状錯体の結合を調節する核タンパク質輸入のモデルと一致しています。

We have used in vitro binding assays to examine specific interactions between a number of cytoplasmic and nuclear pore proteins involved in nuclear protein import in vertebrates. We demonstrate that nuclear transport factor 2 (NTF2), nucleoporin p62 and the Ras-like GTPase Ran bind to the importin heterodimer via its beta subunit. The binding behaviour of p62 truncation mutants indicated that importin-beta interacts primarily with the alpha-helical coiled-coil rod domain of nucleoporin p62 and not with the N-terminal domain that contains a number of degenerate repeats based on the xFxFG sequence motif. The binding of Ran to importin-beta was sensitive to its nucleotide state, with RanGTP binding strongly, whereas RanGDP binding could not be detected using our assay conditions. RanGTP, but not RanGDP, was able to displace p62 bound to the importin alpha/beta complex, suggesting that the binding sites for p62 and RanGTP on importin-beta overlap. Moreover, RanGTP, but not RanGDP, weakened the interaction between importin-alpha and importin-beta in a concentration-dependent manner. NTF2 bound to the importin heterodimer but did not displace p62, suggesting that the NTF2 and p62 binding sites on importin-beta do not overlap. The set of interactions we observed was not altered by the binding of NLS-containing substrates such as transcription factor IIIA to the importin heterodimer. Our results are consistent with models for nuclear protein import in which Ran nucleotide exchange modulates the binding of the importin-substrate complexes during translocation through nuclear pore complexes.