特定の対立遺伝子を双方向に増幅するOverlapping PCR：ホモ接合体とヘテロ接合体を同時に鑑別するための迅速なワンチューブ法

単一塩基の変化の迅速な検出は、分子医学の基本です。PASA（特定の対立遺伝子のPCR増幅）は、シングルベースの変化をジェノタイピングする迅速な方法ですが、各対立遺伝子に1つの反応が必要です。双方向PASA（BI-PASA）は、適切なサイクリング条件で新しいプライマーデザインを利用することにより、1つのPCR反応におけるホモ接合体とヘテロ接合体を区別するために開発されました。Bi-PASAでは、対立遺伝子の1つが一方向のPASA反応によって増幅され、2番目の対立遺伝子は反対方向のPASA反応によって増幅されます。2つの外側（PとQ）と2つの内側の対立遺伝子特異的（AおよびB）プライマーが必要です。ヘテロ接合体では、3つのセグメントが増幅されます。1つの対立遺伝子から生じるサイズAQのセグメント、2番目の対立遺伝子に起因するサイズPBの別のセグメント、およびサイズPQの組み合わせセグメント。ホモ接合体では、セグメントPQおよびセグメントAQまたはPB増幅のいずれか。2つの内側プライマー（AとB）には、比較的短い相補的領域と10ヌクレオチドG + Cが豊富な5 '尾が含まれています。インナープライマーは、ゲノムDNAが以前に増幅されたテンプレートDNAに置き換えられた場合、低効率から高効率増幅に「切り替えます」。さらに、5 '尾は「メガプライミング」を防ぎます。Bi-PASAを最適化するためのパラメーターは、ヒューマン因子Vおよびカテコール-O-メチルトランスフェラーゼ遺伝子の一般的な変異について詳細に調査されました。BI-PASAの最適化のためのガイドラインも開発され、前向き研究でテストされました。これらのガイドラインを利用することにより、3つの追加のBI-PASAアッセイが迅速に最適化されました。結論として、BI-PASAは、単一のPCR反応における既知の変異の酸素性を検出するためのシンプルで迅速な方法です。

Rapid detection of single-base changes is fundamental to molecular medicine. PASA (PCR Amplification of Specific Alleles) is a rapid method of genotyping single-base changes, but one reaction is required for each allele. Bidirectional PASA (Bi-PASA) was developed to distinguish between homozygotes and heterozygotes in one PCR reaction by utilizing novel primer design with appropriate cycling conditions. In Bi-PASA, one of the alleles is amplified by a PASA reaction in one direction while the second allele is amplified by a PASA reaction in the opposite direction. Two outer (P and Q) and two inner allele-specific (A and B) primers are required. In heterozygotes, three segments are amplified: a segment of size AQ resulting from one allele, another segment of size PB resulting from the second allele, and a combined segment of size PQ. In homozygotes, segment PQ and either segments AQ or PB amplify. The two inner primers (A and B) contain a relatively short complementary region and a 10-nucleotide G + C-rich 5' tail. The inner primers "switch" from low-efficiency to high-efficiency amplification when genomic DNA is replaced by previously amplified template DNA. In addition, the 5' tails prevent "megapriming". The parameters for optimizing Bi-PASA were investigated in detail for common mutations in the human factor V and catechol-O-methyltransferase genes. Guidelines for optimization of Bi-PASA also were developed and tested in a prospective study. Three additional Bi-PASA assays were optimized rapidly by utilizing these guidelines. In conclusion, Bi-PASA is a simple and rapid method for detecting the zygosity of known mutations in a single PCR reaction.