カルモジュリンは、ヒト内皮一酸化窒素シンターゼのオキシゲナーゼドメインの二量体化を促進します

内皮酸化酸化物シンターゼ（ENOS）の活性型はホモダイマーです。酵素の活性は、eNOSの活性化を引き起こすカルモジュリン（CAM）の結合を含むカルシウムシグナル伝達によってin vivoで調節されます。酵素のオキシゲナーゼドメインを介したeNOSの二量体化を促進する際のカルシウム媒介カム結合の可能な役割を調べました。ヒトENOSのオキシゲナーゼドメインの組換え型は、原核生物発現系で発現しました。この組換えドメインには、分子酸素によるアルギニン酸化のための触媒シトクロムP-450部位と、テトラヒドロビオプテリンとCa2+-CAMの結合部位が含まれていますが、還元酵素ドメインと関連するFAD、FMN、およびNADPHバインド部位を欠いています。Ca2+-CAMの結合は、蛍光の変化、固有および外因性の両方の変化、およびゲルろ過、化学架橋、および粒子サイジングによって決定されるように、モノマーENOSオキシゲナーゼドメインの関連を引き起こしました。ドメインの二量体化は、基質、アルギニン、または補因子のテトラヒドロビオプテリンの存在に依存していませんでした。Ca2+-CAM結合領域を欠くENOSオキシゲナーゼドメインの切り捨てられた形態は、二量体を形成するために自己同化を受けませんでした。これらの結果は、eNOSレダクターゼドメインがeNOSのCa2+-CAM誘導の二量体化には必要ないことを示しており、この二量体化がCa2+によるENOSの活性化における主要なイベントである可能性を示唆しています。

The active form of endothelial nitric-oxide synthase (eNOS) is a homodimer. The activity of the enzyme is regulated in vivo by calcium signaling involving the binding of calmodulin (CAM), which triggers the activation of eNOS. We have examined the possible role of calcium-mediated CAM binding in promoting dimerization of eNOS through the oxygenase domain of the enzyme. A recombinant form of the oxygenase domain of human eNOS was expressed in a prokaryotic expression system. This recombinant domain contains the catalytic cytochrome P-450 site for arginine oxidation by molecular oxygen as well as the binding sites for tetrahydrobiopterin and Ca2+-CAM but lacks the reductase domain and associated FAD, FMN, and NADPH binding sites. Binding of Ca2+-CAM caused an association of monomeric eNOS oxygenase domain as determined by changes in fluorescence, both intrinsic and extrinsic, and by gel filtration, chemical cross-linking, and particle-sizing. Dimerization of the domain was not dependent on the presence of the substrate, arginine, or the cofactor, tetrahydrobiopterin. A truncated form of the eNOS oxygenase domain lacking the Ca2+-CAM binding region did not undergo self-association to form dimers. These results show that the eNOS reductase domain is not required for Ca2+-CAM-induced dimerization of eNOS and suggest that this dimerization may be a primary event in the activation of eNOS by Ca2+.