ヒトO6-メチルグアニンDNAメチルトランスフェラーゼの活性部位変異体によるDNAにおけるO6-メチルグアニンの特異的認識

ユビキタスなDNA修復タンパク質であるO6-メチルガニンDNAメチルトランスフェラーゼ（MGMT）は、ストイチコメトリック反応を介して変異原性DNA付加物O6-アルキルグアニン（アルキル化発癌によって誘導）を除去するモノマーとして機能します。アルキル基は、207のアミノ酸残基を含むヒトMGMTの場合、補因子なしでMGMTのCys-145の特定のシステイン受容体残基に移し、それによりタンパク質を不活性化します。NMR分光法とX線結晶学を介した自由および基質結合型のその構造の解明によるヒトMGMTの反応メカニズムの調査の前奏曲として、2種類のMGMT変異体が生成され、特徴付けられました。第一に、タンパク質の系統的削除分析を実施して、それが活性または非アクティブな最小サイズを決定しますが、基質と安定した複合体を形成するため、NMR spetroscopic分析に役立つ可能性があります。それぞれアミノまたはカルボキシル末端から8または31以上の残基を削除し、活性と基質結合の両方が失われました。おそらくその三次構造を変化させることにより、Arg-9またはLeu-176および遠位残基の除去がタンパク質を不活性化しました。細菌の過剰発現と溶解度の基準に基づいて、カルボキシル末端で28残基が削除された変異MGMTは、NMR研究に適している必要があります。2番目のアプローチでは、基質結合を保持する活性部位（CYS-145）の変異体を調べました。不活性C145AおよびC145S置換変異体は、O6-メチルグアニン（M6G）を含むオリゴヌクレオチド基質とともに特異的かつ安定した複合体を形成することがわかった。野生型MGMTは、同様の複合体も形成しましたが、一時的な中間体としてのみ形成されました。フットプリント研究では、C145Aの基質DNAへの結合に対する塩基付加物の強い識別効果が示されました。塩基付加物にまたがる相補鎖におけるM6G含有鎖上の17-18ヌクレオチドと相補鎖の13-14ヌクレオチドは、変異タンパク質によるDNase I消化から保護されました。これらの結果は、野生型および変異タンパク質の同一のプロテアーゼ感受性が、活性部位での保存的変異による最小限の構造変化を示唆しています。したがって、変異タンパク質は、ヒトMGMTの構造とメカニズムを解くために利用される可能性があります。

O6-Methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT), a ubiquitous DNA repair protein, acts as a monomer in removing the mutagenic DNA adduct O6-alkylguanine (induced by alkylating carcinogens) via a stoichiometric reaction. The alkyl group is transferred without a cofactor to a specific cysteine acceptor residue of MGMT, Cys-145 in the case of human MGMT, containing 207 amino acid residues and thereby inactivates the protein. As a prelude to the investigation of the reaction mechanism of human MGMT by elucidation of its structure in free and substrate-bound forms via NMR spectroscopy and X-ray crystallography, two types of MGMT mutants were generated and characterized. First, systematic deletion analysis of the protein was carried out to determine the smallest size at which it is active or inactive but forms a stable complex with the substrate and so may be useful for NMR spetroscopic analysis. Deletion of more than 8 or 31 residues from the amino or carboxyl terminus, respectively, led to the loss of both activity and substrate binding. Removal of Arg-9 or Leu-176 and distal residues inactivated the protein, presumably by altering its tertiary structure. On the basis of the criteria of bacterial overexpression and solubility, the mutant MGMT with deletion of 28 residues at the carboxyl terminus should be suitable for NMR studies. In the second approach, we examined mutants at the active site (Cys-145) that retain substrate binding. Inactive C145A and C145S substitution mutants were found to form specific and stable complexes with an O6-methylguanine (m6G)-containing oligonucleotide substrate. Wild type MGMT also formed a similar complex, but only as a transient intermediate. Footprinting studies indicated a strong discriminatory effect of the base adduct on the binding of C145A to substrate DNA; 17-18 nucleotides on the m6G-containing strand and 13-14 nucleotides in the complementary strand spanning the base adduct were protected from DNase I digestion by the mutant protein. These results, as well as the identical protease sensitivity of the wild type and mutant proteins, suggest minimal structural change due to conservative mutations at the active site. Thus, the mutant proteins may be utilized for solving the structure and mechanism of human MGMT.