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B19 DNA配列を定量化するために、競合PCRアッセイが開発されました。ターゲットおよび内部標準シーケンスは、同じプライマーセットによって共増幅されました。内部標準競合他社は組換えPCRによって構築され、同じプライマーのセットによって増幅された領域の内部の21 bp変異誘発フラグメントの元のゲノム配列とは異なりました。内部標準の競合他社は、すべての実験で使用されるプラスミドベクターとクローン化されたフラグメントでクローニングされました。標的および内部標準配列は、共増幅反応中にジゴキシゲニンで標識され、異なるアンプリコンは、元の21-BP配列または変異誘入されたものに特異的なビオチン化プローブによって2つの別々のハイブリダイゼーション反応で検出されました。ハイブリダイズされたアンプリコンは、ストレプトアビジン式マイクロタイトルウェルに捕獲され、ペルオキシダーゼに結合した抗ジゴキシゲニン抗体によって検出されました。ペルオキシダーゼの発色反応は、光学密度測定によって定量的に評価されました。その後開発された滴定曲線は、範囲10（2）から10（5）のゲノムコピーにわたって線形関係を示し、したがって、良好な感度とともに広い範囲で正確な定量的評価を取得しました。B19 DNAおよび8つの陰性血清サンプルに対して陽性の9つの参照血清サンプルは、B19 DNA配列の定量のために競合PCRアッセイによってテストされました。
B19 DNA配列を定量化するために、競合PCRアッセイが開発されました。ターゲットおよび内部標準シーケンスは、同じプライマーセットによって共増幅されました。内部標準競合他社は組換えPCRによって構築され、同じプライマーのセットによって増幅された領域の内部の21 bp変異誘発フラグメントの元のゲノム配列とは異なりました。内部標準の競合他社は、すべての実験で使用されるプラスミドベクターとクローン化されたフラグメントでクローニングされました。標的および内部標準配列は、共増幅反応中にジゴキシゲニンで標識され、異なるアンプリコンは、元の21-BP配列または変異誘入されたものに特異的なビオチン化プローブによって2つの別々のハイブリダイゼーション反応で検出されました。ハイブリダイズされたアンプリコンは、ストレプトアビジン式マイクロタイトルウェルに捕獲され、ペルオキシダーゼに結合した抗ジゴキシゲニン抗体によって検出されました。ペルオキシダーゼの発色反応は、光学密度測定によって定量的に評価されました。その後開発された滴定曲線は、範囲10（2）から10（5）のゲノムコピーにわたって線形関係を示し、したがって、良好な感度とともに広い範囲で正確な定量的評価を取得しました。B19 DNAおよび8つの陰性血清サンプルに対して陽性の9つの参照血清サンプルは、B19 DNA配列の定量のために競合PCRアッセイによってテストされました。
A competitive PCR assay was developed to quantify B19 DNA sequences. Target and internal standard sequences were co-amplified by the same set of primers. The internal standard competitor was constructed by recombinant PCR and differed from the original genome sequence in a 21-bp mutagenized fragment, internal to the region amplified by the same set of primers. The internal standard competitor was cloned in a plasmid vector and the cloned fragment used in all the experiments. Target and internal standard sequences were labelled with digoxigenin during the co-amplification reaction and the different amplicons were detected in two separate hybridization reactions by biotinylated probes specific for the original 21-bp sequence or the mutagenized one. Hybridized amplicons were captured onto streptavidin-oated microtitre wells and detected by anti-digoxigenin antibodies conjugated to peroxidase. The chromogenic reaction for peroxidase was quantitatively evaluated by optical density determination. The titration curve subsequently developed showed a linear relationship over the range 10(2) to 10(5) genome copies, thus obtaining an exact quantitative evaluation over a wide range together with good sensitivity. Nine reference serum samples positive for B19 DNA and eight negative serum samples were tested by the competitive PCR assay for the quantitation of B19 DNA sequences.
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