ECORVエンドヌクレアーゼによるDNA認識部位GATATCへの特異的結合

制限エンドヌクレアーゼECORVは、触媒補因子Mg2+の非存在下で、その特定のDNA部位であるGatatcを非特異的DNA部位と区別できないことが報告されています。対照的に、pHおよび塩濃度の適切な条件下では、GATATC部位を含むオリゴヌクレオチドを含む特定の複合体がフィルター結合またはゲルリターティングのいずれかによって検出できることをここで示します。平衡結合定数（k（a））は、直接平衡と平衡競争法の両方で簡単に測定できます。二重陽イオンの非存在下でのpH 7での「非特異的」結合に対する「特異的」の好みは、約1000倍（オリゴヌクレオチドのモルあたり）または12,000倍（結合部位のモルあたり）です。Ethylation-Interferenceフットプリントは、「特定の」複合体には、リン酸塩グループGPAPTPAPTCへの強力な接触が含まれていることを示しています。特定のDNA結合はpH依存性が強く、pH 6を超える1つのpH単位の増加ごとに約15倍減少しますが、非特異的結合はそうではありません。したがって、結合特異性はpHの増加とともに減少します。pH <or = 7でのゲル遅延とフィルター結合は、特定のサイト結合に対してk（a）の本質的に同一の値を生成しますが、pH> 7ゲル遅延ではk（a）が大幅に過小評価されます。特異的部位結合は、Ca2+（切断のための補因子ではない）で約700倍に刺激されますが、Ca2+に対する反応が親オリゴヌクレオチド、Mg2+刺激剤の反応と類似したものと類似したca2+とca2+への反応が類似している4'-チオデオキシリボース誘導体では、Ca2+によって約700倍刺激されます。それぞれ4倍と2倍のみを結合します。したがって、結合特異性はMg2+によって劇的に強化されません。ホスホジエステル結合固定の拘束力と1次速度定数での差別を考慮すると、誤ったサイトGTTATCに対して行使された全体的な識別は約10（7）倍です。したがって、ECORVエンドヌクレアーゼは、結合特異性のない部位固有の相互作用の「新しいパラダイム」ではありませんが、他のタイプII制限エンドヌクレアーゼと同様に、DNA結合と触媒の両方を区別することにより配列特異性を達成します。

Restriction endonuclease EcoRV has been reported to be unable to distinguish its specific DNA site, GATATC, from non-specific DNA sites in the absence of the catalytic cofactor Mg2+, and thus to exercise sequence specificity solely in the catalytic step. In contrast, we show here that under appropriate conditions of pH and salt concentration, specific complexes with oligonucleotides containing the GATATC site can be detected by either filter-binding or gel-retardation. Equilibrium binding constants (K(A)) are easily measured by both direct equilibrium and equilibrium-competition methods. The preference for "specific" over "non-specific" binding at pH 7 in the absence of divalent cations is about 1000-fold (per mole of oligonucleotide) or 12,000-fold (per mole of binding sites). Ethylation-interference footprinting shows that the "specific" complex includes strong contacts to the phosphate groups GpApTpApTC. Specific DNA binding is strongly pH-dependent, decreasing about 15-fold for each increase of one pH unit above pH 6, but non-specific binding is not; thus, binding specificity decreases with increasing pH. Gel retardation and filter-binding at pH < or = 7 yield essentially identical values of K(A) for specific-site binding, but at pH > 7 gel retardation significantly underestimates K(A). Specific-site binding is stimulated about 700-fold by Ca2+ (not a cofactor for cleavage), but with non-cleavable 3'-phosphorothiolate and 4'-thiodeoxyribose derivatives whose response to Ca2+ is similar to that of the parent oligonucleotide, Mg2+ stimulates binding only fourfold and twofold, respectively. Thus, binding specificity is not dramatically enhanced by Mg2+. Taking into account discrimination in binding and in the first-order rate constant for phosphodiester bond scission, the overall discrimination exercised against the incorrect site GTTATC is about 10(7)-fold. EcoRV endonuclease is thus not a "new paradigm" for site-specific interaction without binding specificity, but like other type II restriction endonucleases achieves sequence specificity by discriminating both in DNA binding and in catalysis.