キスループ複合体における非標準的な相互作用：HIV-1ゲノムRNAの二量体化開始部位

レトロウイルスは、ダイマーリンケージ構造（DLS）と呼ばれる領域で5 '端に近い近くで非共有結合されているゲノムRNAの2つの分子を包み込みます。ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）の二量体化開始部位（DIS）は、in vitroでDLSの重要な部分を構成し、細胞培養における効率的なHIV-1複製に不可欠です。以前に、DISを主要なスプライスドナー部位の上流に位置するヘアピン構造として特定しました。これには、それぞれ2つと1つのプリンがそれぞれ6ヌクレオチドの自己補完的なシーケンスが含まれています。2つのRNAモノマーは、6つのヌクレオチドの自己補完配列の分子間相互作用を介してキスループ複合体を形成します。ここでは、自己修正配列および/または隣接するプリンの変異に代償的変異を導入しました。二量体化の速度論、熱安定性、および野生型および変異体二量体の見かけの平衡解離定数を決定し、構造情報を取得するために化学調査を使用しました。我々の結果は、5'Flankingプリンの重要性と、二量体化プロセスにおける自己補完シーケンスの2つの中心的な基盤の重要性を示しています。実験データは、キスヘリックスの深い溝のこれらの残基間のトリプル相互作用によって合理化され、キスループダイマーの3次元モデルに組み込まれます。さらに、化学プロービングと分子モデリングは、ディスループの最初と最後の位置で保存されたアデニン残基間の非標準的な相互作用の存在を支持します。さらに、HIV-1ゲノムRNAのスプライスドナー部位の下流に位置する配列を含む相互作用によって、DISでのキスループ複合体の不安定化が補償できることを示します。

Retroviruses encapsidate two molecules of genomic RNA that are noncovalently linked close to their 5' ends in a region called the dimer linkage structure (DLS). The dimerization initiation site (DIS) of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) constitutes the essential part of the DLS in vitro and is crucial for efficient HIV-1 replication in cell culture. We previously identified the DIS as a hairpin structure, located upstream of the major splice donor site, that contains in the loop a six-nucleotide self-complementary sequence preceded and followed by two and one purines, respectively. Two RNA monomers form a kissing loop complex via intermolecular interactions of the six nucleotide self-complementary sequence. Here, we introduced compensatory mutations in the self-complementary sequence and/or a mutation in the flanking purines. We determined the kinetics of dimerization, the thermal stabilities and the apparent equilibrium dissociation constants of wild-type and mutant dimers and used chemical probing to obtain structural information. Our results demonstrate the importance of the 5'-flanking purine and of the two central bases of the self-complementary sequence in the dimerization process. The experimental data are rationalized by triple interactions between these residues in the deep groove of the kissing helix and are incorporated into a three-dimensional model of the kissing loop dimer. In addition, chemical probing and molecular modeling favor the existence of a non-canonical interaction between the conserved adenine residues at the first and last positions in the DIS loop. Furthermore, we show that destabilization of the kissing loop complex at the DIS can be compensated by interactions involving sequences located downstream of the splice donor site of the HIV-1 genomic RNA.