チック筋筋細胞に対するムスカリン性コリン作動性受容体の視覚化とホスファチジルコリン加水分解へのそれらの関与

この研究の目的は、ムスカリン受容体と心筋細胞でのその分布を視覚化し、ホスファチジルコリン加水分解に対するカルバコールによるムスカリンコリン作動性受容体（MACH-R）刺激の効果を調べることでした。心筋細胞は、7日齢のニワトリ胚の心臓からの主要な培養として調製されました。カバースリップ上で成長した心筋細胞を、ムスカリン受容体拮抗薬ピレンゼピンの蛍光類似体であるBodipy PZで標識し、レーザー走査型共焦点顕微鏡で検査しました。1.0ミクロン。セルあたりの受容体クラスターの数は83.5 +/- 6.8（平均+/- SEM）であり、セルの周辺でクラスターが見つかりました。皿中の単層として成長した心筋細胞を、マッハ-Rアゴニストである10（-4）Mカルバコールで処理し、ホスファチジルコリン加水分解に対する効果は、[メチル-3H]コリンと18時間インキュベートした細胞で確認されました。細胞を洗浄し、溶解し、薄層クロマトグラフィーを誘導して、ホスファチジルコリンのさまざまな代謝産物で[3H]コリンを分離しました。カルバコールは有意に（P <0.05）、細胞内遊離コリンを増加させ、ホスファチジルコリン加水分解と一致する細胞リン脂質の減少を減少させました。カルバコルは、心筋細胞から培地に流出した[3H]コリンの量を増加させました。カルバコール誘発コリン流出は、ホスホリパーゼD阻害剤であるN-ブタノールによる前処理によって予防されず、ホスホリパーゼCなどの他のリパーゼがホスファチジルコリン加水分解に関与する主要な酵素であることを示唆しています。百日咳毒素は、カルバコル誘発コリン流出と細胞内遊離コリンとリン脂質の変化を防ぎました。Gタンパク質を介したカルバコルの作用は、イソプロテレノールからのcAMP生成におけるカルバコール誘発性の減少に敵対する百日咳毒素の能力によって支持されました。要約すると、生きている心筋細胞で視覚化されたMACH-RSは、核の末梢でした。マック-R刺激によって誘導されるホスファチジルコリン加水分解は、心筋細胞のマック-Rのシグナル伝達経路であり、百日咳毒素に敏感な阻害性Gタンパク質を介して動作します。

The purpose of this study was to visualize muscarinic receptors and their distribution on cardiomyocytes and to examine the effects of muscarinic cholinergic receptor (mACh-R) stimulation with carbachol on phosphatidylcholine hydrolysis. Cardiomyocytes were prepared as primary culture from 7-day-old chick embryo hearts. Cardiomyocytes, grown on cover slips, were labelled with BODIPY PZ, a fluorescent analog of the muscarinic receptor antagonist pirenzepine, and examined with a laser scanning confocal microscope, mACh-R clusters were visualized and were fairly homogeneous in size with diameters ranging from 0.5 to 1.0 micron. The number of receptor clusters per cell was 83.5 +/- 6.8 (mean +/- SEM) and clusters were found at the periphery of the cell. Cardiomyocytes, grown as a monolayer in dishes, were treated with the 10(-4) M carbachol, a mACh-R agonist, and the effects on phosphatidylcholine hydrolysis were ascertained in cells preincubated with [methyl-3H]choline for 18 h. Cells were washed, lysed, and subjected to thin-layer chromatography to separate [3H]choline in various metabolites of phosphatidylcholine. Carbachol significantly (p < 0.05) increased intracellular free choline and decreased cellular phospholipid consistent with phosphatidylcholine hydrolysis. Carbachol increased the amount of [3H]choline that effluxed out of the cardiomyocyte into the medium. Carbachol-induced choline efflux was not prevented by pretreatment with n-butanol, a phospholipase D inhibitor, suggesting that other lipases such as phospholipase C are the major enzyme involved in phosphatidylcholine hydrolysis. Pertussis toxin prevented carbachol-induced choline efflux and the changes in intracellular free choline and phospholipid. An action of carbachol through G proteins was supported by the ability of pertussis toxin to antagonize the carbachol-induced reduction in cAMP generation from isoproterenol. In summary, mACh-Rs, visualized in living cardiomyocytes, were peripheral to the nucleus. Phosphatidylcholine hydrolysis induced by mACh-R stimulation may be a signal transduction pathway for mACh-R in the cardiomyocyte, operating through inhibitory G proteins sensitive to pertussis toxin.