厳密にNAD+特異的酵素の部位指向的な突然変異誘発により、NADP+に対して好ましい特異性を持つ新しいロイシンデヒドロゲナーゼの構築

Thermoactinomyces intermediusとNADP+依存性のデヒドロゲナーゼのNAD+依存性ロイシンデヒドロゲナーゼ（LEUDH）の配列比較に基づいて、LeudHのコエンザイム特異性を決定することになっているアミノ酸残基のセットが割り当てられました。これらのアミノ酸を他のアミノ酸に系統的に置き換えることは、NADP+を好む新しいものにその天然のコエンザイム特異性を切り替えることを目的として行われました。シングルD203A、ダブルD203A-I204RおよびトリプルD203A-I204R-D210R変異酵素が構築されました。野生型LeudhはNADP+で非アクティブです。ただし、D203Aシングル変異体は、両方の補酵素で本質的に同一のK（CAT）/km値を持つNAD+およびNADP+のデュアル特異性を示しましたが、値は野生型酵素の値よりも3桁低かった。二重変異体D203A-I204Rでの203での負電荷の除去とともに204での正電荷の導入により、酵素はNADP+に対する有意に高い親和性を提供しました。NADP+の最良のK（CAT）/km値は、野生型酵素のK（CAT）/km値の2％以上で、トリプル変異体D203A-I204R-D210Rについて示されました。したがって、私たちは、非常に活性なNADP+（特定の活性、19マイクロモール/mg/min）を好む新しいコエンザイム特異性を備えた変異体leudhの構築に成功しました。

On the basis of sequence comparison between NAD+-dependent leucine dehydrogenase (LeuDH) from Thermoactinomyces intermedius and NADP+-dependent dehydrogenases, a set of amino acid residues that are supposed to determine the coenzyme specificity of LeuDH were assigned. Systematic replacement of these amino acids by others was done with the aim to switch its natural coenzyme specificity to a new one preferring NADP+. Single D203A, double D203A-I204R and triple D203A-I204R-D210R mutation enzymes were constructed. The wild-type LeuDH is inactive with NADP+. However, D203A single mutant exhibited dual specificity for NAD+ and NADP+ with essentially identical k(cat)/Km values for both coenzymes, but the values were three orders of magnitude lower than that of the wild-type enzyme. Introduction of positive charge at 204 together with the removal of the negative charge at 203 in the double mutant D203A-I204R provided the enzyme with significantly high affinity for NADP+. The best k(cat)/Km value for NADP+ was shown for the triple mutant D203A-I204R-D210R: more than 2% of the k(cat)/Km value of the wild-type enzyme. Thus, we succeeded in constructing a mutant LeuDH with a new coenzyme specificity preferring NADP+ which is highly active (specific activity, 19 micromol/mg/min).