マイトジェン活性化プロテインキナーゼERK2のレベルでのシッフベースの共刺激シグナル伝達とTCRシグナル伝達の収束

特殊なT細胞表面アミン上のシッフ塩基形成は、Na+およびK+輸送を活性化するメカニズムを介してT細胞に共刺激シグナルを提供し、TCR依存性のIL-2産生を大幅に増強します。天然カルボニルドナーを模倣するシッフ塩基形成分子は、免疫応答を強力に促進し、最初のメカニズムベースの経口活性免疫移植剤を提供します。本研究では、シフ塩基形成分子トゥカレソールによる共刺激を、T細胞株のマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）のレベルで調査しました。抗CD3によるTCR指向刺激とツカレソールによるシッフ塩基刺激の両方は、リン酸化の増加に対応するSDS-PAGEにさらされた細胞溶解物タンパク質の直接的な免疫ブロットを特徴とするMAPKの明確な移動性シフトを生成しました。TCR-CD3とトゥカレソール刺激を組み合わせて、MAPK応答を大幅に強化および延長し、シッフベースシグナル伝達によって利用される経路の共刺激性の生化学的基盤を提供しました。影響を受けるMAPKは、免疫沈降によりERK2として特定されました。MAPK活性化に対するツカレソールの直接効果とTCRシグナル強化効果の両方が、基質リン酸化を測定する機能的MAPKアッセイでも実証されました。Tucaresolのシッフ塩基形成カルボニル基のホウ酸水素の減少は、MAPKKの選択的阻害剤であるMEK1と同様に、MAPKリン酸化とIL-2産生の増強とIL-2産生の両方を廃止しました。トゥカレソールは、細胞内遊離Ca2+またはイノシトール1,4,5-三リン酸生成のTCRを介した上昇に影響を与えませんでしたが、トゥカレソールシグナル伝達はLCK欠損J.CAM1.6 T細胞株で正常に発生しました。TCR誘発性シグナルは、初期のTCRを介したイベントの下流です。

Schiff base formation on specialized T cell surface amines provides a costimulatory signal to T cells through a mechanism that activates Na+ and K+ transport, substantially enhancing TCR-dependent IL-2 production. Schiff base-forming molecules that mimic the natural carbonyl donor potently enhance immune responses and provide the first mechanism-based, orally active immunopotentiatory agents. In the present study, costimulation by the Schiff base-forming molecule tucaresol was investigated at the level of mitogen-activated protein kinase (MAPK) in T cell lines. Both TCR-directed stimulation by anti-CD3 and Schiff base stimulation by tucaresol produced a distinct mobility shift in MAPK, characterized by direct immunoblotting of cell lysate proteins subjected to SDS-PAGE, that corresponded with increased phosphorylation. Combined TCR-CD3 and tucaresol stimulation substantially enhanced and prolonged the MAPK response, providing a biochemical basis for the costimulatory nature of the pathway utilized by Schiff base signaling. The MAPK affected was identified by immunoprecipitation as ERK2. Both the direct effects and the TCR signal-enhancing effects of tucaresol on MAPK activation were also demonstrated in a functional MAPK assay measuring substrate phosphorylation. Borohydride reduction of tucaresol's Schiff base-forming carbonyl group abolished both enhancement of MAPK phosphorylation and IL-2 production, as did a selective inhibitor of the MAPKK, MEK1. Tucaresol had no effect on TCR-mediated rises in intracellular free Ca2+ or inositol 1,4,5-triphosphate generation, while tucaresol signaling occurred normally in the lck-deficient J.CaM1.6 T cell line, consistent with convergence of tucaresol- and TCR-induced signals downstream of early TCR-mediated events.