そのシス調節モチーフの最小マウスMSX-1遺伝子プロモーター組織と、培養およびトランスジェニックマウスの細胞における転写活性化におけるそれらの役割

従来のTATA要素、推定MSX-1プロモーターDNAフラグメント（-1282から+106塩基対（BP））またはその部位固有の同性体を欠くマウスMSX-1プロモーターのシス調節エレメントを分析するために変化はルシフェラーゼレポーターに融合し、NIH3T3およびC2C12細胞に導入され、ルシフェラーゼの発現を一時的な発現アッセイで評価しました。プロモーターの連続的な5 '削除の機能的結果は、複数の正と負の調節要素がMSX-1遺伝子の転写の調節に関与することを明らかにしました。しかし、驚くべきことに、NIH3T3またはC2C12細胞のいずれかでのMSX-1プロモーターの最適な発現は、その構造の詳細な調査を保証するために、上流シーケンスの165 bpのみを必要としました。したがって、最小MSX-1プロモーターのCIS作用要素の部位固有の削除と点変異の機能的結果を体系的に調べました。同時に、最小プロモーターのシス作動要素と相互作用する潜在的な転写因子も、ゲル電気泳動移動シフトアッセイとDNase Iフットプリントによって研究されました。DNase Iフットプリント、電気泳動移動度シフトアッセイ、および特定の抗体によるスーパーシフトアッセイによる最小プロモーターの組み合わせ分析により、MSX -1プロモーターの-161から-154、-26から-13から-26から-13の分析により、MSX -1プロモーターの-26から-13が含まれることが明らかになりました。それぞれ上流の刺激因子1（USF-1）に免疫学的に関連するタンパク質を結合することができる本物のEボックス（近位Eボックス）と、それぞれSP1（近位SP1）に結合できるGCリッチシーケンスモチーフ。さらに、近位Eボックスを除去または変異させた場合、プロモーターの活性化が深刻に妨げられ、近位SP1部位が同様に変更された場合、プロモーター活性が完全に排除されたことが観察されました。SP1に対するMSX-1最小プロモーターの絶対依存性は、MSX-1-ルシフェラーゼとSP1発現ベクターPPACSP1を共産系化したSP1欠損ショウジョウバエ細胞株における一過性発現アッセイによって実証できます。ゲノムに-165/106-bp MSX-1プロモーター-LACZ DNAを含むトランスジェニックマウス胚は、上顎と下顎のベータガラクトシダーゼ、およびスカルの髄膜と骨の形成に関与する細胞原始で豊富に発現しました。したがって、切り捨てられたマウスMSX-1プロモーターは、内因性MSX-1遺伝子の高レベルの発現で知られているトランスジェニック胚の頭蓋顔面組織における異種遺伝子の発現を標的とすることができ、MSX-1ノックアウトで重度に欠陥があることがわかったマウス。

To dissect the cis-regulatory elements of the murine Msx-1 promoter, which lacks a conventional TATA element, a putative Msx-1 promoter DNA fragment (from -1282 to +106 base pairs (bp)) or its congeners containing site-specific alterations were fused to luciferase reporter and introduced into NIH3T3 and C2C12 cells, and the expression of luciferase was assessed in transient expression assays. The functional consequences of the sequential 5' deletions of the promotor revealed that multiple positive and negative regulatory elements participate in regulating transcription of the Msx-1 gene. Surprisingly, however, the optimal expression of Msx-1 promoter in either NIH3T3 or C2C12 cells required only 165 bp of the upstream sequence to warrant detailed examination of its structure. Therefore, the functional consequences of site-specific deletions and point mutations of the cis-acting elements of the minimal Msx-1 promoter were systematically examined. Concomitantly, potential transcriptional factor(s) interacting with the cis-acting elements of the minimal promoter were also studied by gel electrophoretic mobility shift assays and DNase I footprinting. Combined analyses of the minimal promoter by DNase I footprinting, electrophoretic mobility shift assays, and super shift assays with specific antibodies revealed that 5'-flanking regions from -161 to -154 and from -26 to -13 of the Msx-1 promoter contains an authentic E box (proximal E box), capable of binding a protein immunologically related to the upstream stimulating factor 1 (USF-1) and a GC-rich sequence motif which can bind to Sp1 (proximal Sp1), respectively. Additionally, we observed that the promoter activation was seriously hampered if the proximal E box was removed or mutated, and the promoter activity was eliminated completely if the proximal Sp1 site was similarly altered. Absolute dependence of the Msx-1 minimal promoter on Sp1 could be demonstrated by transient expression assays in the Sp1-deficient Drosophila cell line cotransfected with Msx-1-luciferase and an Sp1 expression vector pPacSp1. The transgenic mice embryos containing -165/106-bp Msx-1 promoter-LacZ DNA in their genomes abundantly expressed beta-galactosidase in maxillae and mandibles and in the cellular primordia involved in the formation of the meninges and the bones of the skull. Thus, the truncated murine Msx-1 promoter can target expression of a heterologous gene in the craniofacial tissues of transgenic embryos known for high level of expression of the endogenous Msx-1 gene and found to be severely defective in the Msx-1 knock-out mice.