組換えタンパク質製剤からのエンドトキシンの除去

目的：大規模大腸菌組換えタンパク質精製からエンドトキシンを除去する効果的な方法を開発する。 設計と方法：トリトンX-114相分離、固定化ポリミキシンBまたは固定化ヒスチジンを利用したアフィニティクロマトグラフィーを使用して、組換えCK-BB、CK-MB、CK-MM、ミオグロビン、および心臓トロポニンI.エンドトキシンレベルは、Limulus Amebocyte Lysate Gel-Clotアッセイによって測定されました。これらのタンパク質製剤の免疫活性は、社内で生成されたモノクローナル抗体のパネルを使用したバイアコア分析と、層蛍光分析器によって決定されました。トロポニンIの場合、バイアコアもトロポニンC相互作用を測定するために利用されました。 結果：トリトンX-114による相分離は、ポリミキシンBまたはヒスチジンアフィニティクロマトグラフィーのいずれかと比較して、タンパク質製剤に存在するエンドトキシンの量を減らす最も効果的な方法でした。Triton X-114の場合、エンドトキシンレベルの低下は99％を超え、エンドトキシン除去後のタンパク質の回復は90％を超えました。エンドトキシンを除去するための3つの手順はすべて、モノクローナル抗体のパネルでテストされたときに、多数タンパク質の免疫活性に有害な影響を与えませんでした。トロポニンIは、Ca2+の存在下でトロポニンCに結合する能力も保持しました。大腸菌細胞溶解物の可溶性画分で発現した組換えCK-BBおよびCK-MMは、包有物体の形で発現した組換えCK-MB、ミオグロビンおよび心臓トロポニンIよりも有意に高いエンドトキシンレベルを含んでいた。 結論：テストした3つの方法のうち、Triton X-114相分離は、組換えタンパク質からエンドトキシンを除去する最も効果的な方法でした。

OBJECTIVES: To develop an effective method to remove endotoxin from large scale E. coli recombinant protein purifications. DESIGN AND METHODS: Triton X-114 phase separation, affinity chromatography utilizing immobilized polymyxin B or immobilized histidine, were used to remove endotoxin from purified preparations of recombinant CK-BB, CK-MB, CK-MM, myoglobin, and cardiac troponin I. Endotoxin levels were measured by a Limulus Amebocyte Lysate gel-clot assay. The immunoactivity of these protein preparations was determined by BIAcore analysis using a panel of in-house generated monoclonal antibodies and by a Stratus Fluorometric Analyzer. In the case of troponin I, the BIAcore was also utilized to measure troponin C interactions. RESULTS: Phase separation with Triton X-114 was the most effective method in reducing the amount of endotoxin present in the protein preparations compared to either polymyxin B or histidine affinity chromatography. With Triton X-114, the reduction in endotoxin levels was greater than 99% and recovery of the proteins after endotoxin removal was greater than 90%. All three procedures for removing endotoxin had no deleterious effects on the immunoactivity of majority proteins when tested with a panel of monoclonal antibodies. Troponin I also retained its ability to bind to troponin C in the presence of Ca2+. Recombinant CK-BB and CK-MM which were expressed in the soluble fraction of E. coli cell lysates, contained significantly higher endotoxin levels than recombinant CK-MB, myoglobin and cardiac troponin I which were expressed in the form of inclusion bodies. CONCLUSION: Of the three methods tested, Triton X-114 phase separation was the most effective way of removing endotoxin from recombinant proteins.