Ku70との相互作用のためにKu80の最小ドメインを定義する

Kuタンパク質は、たとえば電離放射線またはVDJの再結合中に誘導される二本鎖DNA休憩の修復において重要な機能を持っています。KUは、DNA依存性キナーゼのDNA結合サブユニットとして機能し、80および70 kDaサブユニットで構成されるヘテロ二量体タンパク質です。2ハイブリッドシステムを使用して、KUサブユニットの相互作用ドメインを分析し、KUの追加パートナーを特定しました。KUヘテロダイマーとの人間のcDNAライブラリをスクリーニングしても、新しいパートナーは明らかにされませんでした。個々のサブユニットをスクリーニングすると、Ku80と相互作用するKu70クローンのみを検出し、Ku70と相互作用するKu80クローンのみを検出し、これらが互いに主要なパートナーであることを示しました。Ku80とKu70はヘテロダイマーのみを形成し、同性化しませんでした。Ku80は、一度に1つのKu70分子との相互作用に制限されていました。Ku70と相互作用したKu80の最小機能相互作用ドメインが定義されました。アミノ酸449から477まで伸びる28アミノ酸領域で構成されていました。この領域は、Ku70との相互作用に重要でした。これは、アミノ酸453および454のこの重要な部位内の突然変異がKu70と相互作用する能力を廃止したためです。さらに、同じ領域が両方のサブユニットのin vitro共翻訳に続いて抗Ku70抗体を伴う免疫沈降を使用してKu70との相互作用に重要であることを検証しました。Ku80のこの相互作用ドメインには、タンパク質間相互作用で以前に認識されていたモチーフは含まれていません。

The Ku protein has a critical function in the repair of double-strand DNA breaks induced for example by ionizing radiation or during VDJ recombination. Ku serves as the DNA-binding subunit of the DNA-dependent kinase and is a heterodimeric protein composed of 80- and 70-kDa subunits. We used the two-hybrid system to analyze the interaction domains of the Ku subunits and to identify possible additional partners for Ku. Screening a human cDNA library with the Ku heterodimer did not reveal any novel partners. Screening with the individual subunits, we detected only Ku70 clones interacting with Ku80 and only Ku80 clones interacting with Ku70, indicating that these are the primary partners for one another. Ku80 and Ku70 formed only heterodimers and did not homodimerize. Ku80 was restricted to interacting with just one Ku70 molecule at a time. The minimal functional interaction domain of Ku80 that interacted with Ku70 was defined. It consisted of a 28-amino acid region extending from amino acid 449 to 477. This region was crucial for interaction with Ku70, since mutation within this critical site at amino acids 453 and 454 abrogated the ability to interact with Ku70. We furthermore verified that the same region is crucial for interaction with Ku70 using in vitro co-translation of both subunits followed by an immunoprecipitation with anti-Ku70 antibodies. This interaction domain of Ku80 does not contain any motif previously recognized in protein-protein interactions.