リン酸化の触媒メカニズムとCheyの脱リン酸化：リン酸塩としてのイミダゾールリン酸イミダゾールの運動特性と酸触媒の役割

さまざまなpH条件にわたって実施されたチャイを含むリントランスフェスイベントの運動および平衡測定は、リントランスフェファーメカニズムのいくつかの特徴を明らかにしました。リン酸化のモニターとしてトリプトファン蛍光強度測定を使用して、小分子リン酸化を使用したリン酸化が、チャイとホスホドナーとの高速関連によって発生し、その後に速度制限リントランスフェを発生させることを示しました。以前に特徴付けられていない2つのホスホドナー、モノホスホイミダゾールとジフォスホイイムダゾールは、前述のリン酸塩アセチルリン酸およびホスホラミデートの濃度よりも約6倍低い濃度でCheyをリン酸化することができました。これは、イミダゾールリン酸塩のチャイへの結合が緊密に結合されていることが示されており、チャイとイミダゾール群の間の結合相互作用の存在を暗示していることが示されました。5〜10のpH範囲を介して自己リン酸化するチャイの能力は、さまざまなホスホドナーで異なっていました。リン酸アセチルとジフォスホスイミダゾールはこの範囲でpHの影響を受けませんでしたが、ホスホラミデートとモノホスホイミダゾールは、モノホスホイミダゾールのpH 7.4（中点）およびリン酸塩のpH 7.8（中点）でのpH 7.4（中点）のリン酸化能力の喪失を伴うpHに急勾配依存性を示しました。この挙動は、モノホスホイミダゾールとホスホラミデートの両方における窒素 - リン結合の窒素原子の陽性電荷の喪失と相関し、チェイは小分子でホスホトランファーの脱離群にプロトンを寄付することができないことを暗示しました。[32p] Chea-リン酸から野生型Cheyへのリントランスファーの速度も、pH 7.5と10の間で著しく（> 150倍）減少しました。アルカリ範囲の活性は、これらの活性部位残基のいずれのいずれの脱プロトン化に起因することはありませんでした。この観察結果は、野生型Cheyの変異体と比較してこれらの変異体のリン引き出し速度の中程度の減少と相まって、Thr87またはLys109のいずれかがリン配線の触媒において直接的な役割を果たす可能性は低いことを示しています。最後に、Cheyのオートデフリン酸化速度は、4.5-11の範囲にわたってpHに依存しないことを示しました。一緒に、これらの研究はモデルにつながり、Cheyは独自のリン酸化と脱リン酸化において主にエントロピー的な役割を果たしました。

Kinetic and equilibrium measurements of phosphotransfer events involving CheY carried out over a range of pH conditions elucidated several features of the phosphotransfer mechanism. Using tryptophan fluorescence intensity measurements as a monitor of phosphorylation, we showed that phosphorylation using small molecule phosphodonors occurred by fast association of CheY with the phosphodonor, followed by rate-limiting phosphotransfer. Two previously uncharacterized phosphodonors, monophosphoimidazole and diphosphoimdazole, were able to phosphorylate CheY at a concentration about 6-fold lower than that of the previously described phosphodonors acetyl phosphate and phosphoramidate. This was shown to be due to tighter binding of the imidazole phosphates to CheY and implied the presence of binding interactions between CheY and the imidazole group. The ability of CheY to autophosphorylate through the pH range of 5-10 differed for various phosphodonors. Acetyl phosphate and diphosphoimidazole were unaffected by pH over this range, whereas phosphoramidate and monophosphoimidazole showed a steep dependence on pH with a loss of phosphorylation ability at about pH 7.4 (midpoint) for monophosphoimidazole and pH 7.8 (midpoint) for phosphoramidate. This behavior correlated with the loss of the positive charge on the nitrogen atom in the nitrogen-phosphorus bond in both monophosphoimidazole and phosphoramidate and implied that CheY was not capable of donating a proton to the leaving group in phosphotransfer with small molecules. The rate of phosphotransfer from [32P]CheA-phosphate to wild type CheY also decreased markedly (> 150 times) between pH 7.5 and 10. Because the mutant CheY proteins K109R and T87A showed the same pH dependence as the wild type, the loss of activity in the alkaline range could not be attributed to deprotonation of either of these active site residues. This observation, combined with the moderate decreases in phosphotransfer rates for these mutants relative to that of wild type CheY, indicated that it is unlikely that either Thr87 or Lys109 plays a direct role in the catalysis of phosphotransfer. Finally, we showed that the rate of autodephosphorylation of CheY was independent of pH over the range of 4.5-11. Together, these studies led to a model with CheY playing a largely entropic role in its own phosphorylation and dephosphorylation.