システインとジスルフィドスキャンは、アスパラギン酸受容体の細胞質ドメインにおける調節アルファヘリックスを明らかにしています

大腸菌およびサルモネラ菌菌の膜貫通、ホモダイマーアスパラギン酸受容体は、細胞質ヒスチジンキナーゼの活性を調節することにより、誘引剤であるアスパラギン酸塩に対する走化性反応を制御します。受容体の細胞質ドメインは、キナーゼの調節と感覚適応の両方で中心的な役割を果たしますが、その構造と調節メカニズムは不明です。本研究では、システインおよびジスルフィドスキャンを利用して、細胞質ドメイン内の2つの適応メチル化セグメントの最初を含む領域であるGLN-309を介して残留物をプローブします。スキャン変異誘発による連続したシステイン残基が導入された後、スルフヒドリル化学反応性の測定により、残基270-309にまたがる露出した埋も位置のアルファヘリカルパターンが明らかになります。「最初のメチル化ヘリックス」と呼ばれるこの検出されたヘリックスは、強く両親媒性です。その露出した顔は非常にアニオン性であり、3つのメチル化部位を所有していますが、その埋められた顔は疎水性です。in vivoおよびin vitro受容体機能のin vitroアッセイは、阻害性システイン置換が最初のメチル化ヘリックスの埋もれた面で最も一般的であることを示しており、この顔が重要な梱包相互作用に関与していることを示しています。埋もれた顔は、ジスルフィドスキャンによってさらに分析され、そのキナーゼ活性化状態に受容体を共有結合して閉じ込める3つの「ロックオン」ジスルフィドが明らかになります。ロックオンジスルフィドのそれぞれは、二量体の2つの対称的な最初のメチル化ヘリックスの埋められた面と架橋され、これらのヘリックスをサブユニットインターフェイスに直接接触させます。56の関連受容体の比較配列分析は、特定されたヘリックスがこの大規模な受容体ファミリーの保存された特徴であることを示唆しており、適応とキナーゼ調節において一般的な役割を果たす可能性が高い。興味深いことに、スキャンされた領域内のジスルフィド形成反応の迅速な速度と乱雑な性質は、全長の膜結合受容体の細胞質ドメインが非常に動的な構造を持っていることを明らかにしています。全体として、結果は、システインとジスルフィドスキャンが、他の構造法にはアクセスできないタンパク質でさえ、二次構造要素と機能的に重要な梱包界面を特定できることを示しています。

The transmembrane, homodimeric aspartate receptor of Escherichia coli and Salmonella typhimurium controls the chemotactic response to aspartate, an attractant, by regulating the activity of a cytoplasmic histidine kinase. The cytoplasmic domain of the receptor plays a central role in both kinase regulation and sensory adaptation, although its structure and regulatory mechanisms are unknown. The present study utilizes cysteine and disulfide scanning to probe residues Leu-250 through Gln-309, a region that contains the first of two adaptive methylation segments within the cytoplasmic domain. Following the introduction of consecutive cysteine residues by scanning mutagenesis, the measurement of sulfhydryl chemical reactivities reveals an alpha-helical pattern of exposed and buried positions spanning residues 270-309. This detected helix, termed the "first methylation helix," is strongly amphiphilic; its exposed face is highly anionic and possesses three methylation sites, while its buried face is hydrophobic. In vivo and in vitro assays of receptor function indicate that inhibitory cysteine substitutions are most prevalent on the buried face of the first methylation helix, demonstrating that this face is involved in a critical packing interaction. The buried face is further analyzed by disulfide scanning, which reveals three "lock-on" disulfides that covalently trap the receptor in its kinase-activating state. Each of the lock-on disulfides cross-links the buried faces of the two symmetric first methylation helices of the dimer, placing these helices in direct contact at the subunit interface. Comparative sequence analysis of 56 related receptors suggests that the identified helix is a conserved feature of this large receptor family, wherein it is likely to play a general role in adaptation and kinase regulation. Interestingly, the rapid rates and promiscuous nature of disulfide formation reactions within the scanned region reveal that the cytoplasmic domain of the full-length, membrane-bound receptor has a highly dynamic structure. Overall, the results demonstrate that cysteine and disulfide scanning can identify secondary structure elements and functionally important packing interfaces, even in proteins that are inaccessible to other structural methods.