芳香族炭化水素受容体の構成的活性化

リガンド活性化芳香族炭化水素受容体（AHR）は、AHR核トランスロケーター（ARNT）とともに二量体化して、ダイオキシン依存性の[AH]遺伝子バッテリーにおけるシトクロムP-450 CYP1A1遺伝子および他の遺伝子の発現をトランス活性化する機能的複合体を形成します。この研究室からの以前の研究は、CYP1A1酵素の活性がこのプロセスを負に調節することを示しています。CYP1A1活性とAH受容体の活性化との関係を研究するために、CYP1A1欠損マウス肝腫C37細胞とCYP1A1-およびAHR欠損アフリカングリーンモンキー腎臓CV-1細胞を使用しました。ゲルモビリティシフトとルシフェラーゼレポーター遺伝子発現アッセイを使用して、外因性AH受容体リガンドにさらされていないC37細胞にはすでに転写活性AHR-ARNT複合体が含まれていることがわかりました。Ellipticine、CYP1A1阻害剤。CV-1細胞では、AHRおよびARNTの一時的な発現は、アゴニストが存在しない場合でも、高レベルのAHR-ARNT依存性ルシフェラーゼ遺伝子発現につながります。緑色の蛍光タンパク質タグ付きAHRを使用して、レポーター遺伝子発現の上昇がAHRの構成的核局在と相関することを示しました。CV-1細胞で観察されたルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写活性化は、（I）機能的CYP1A1酵素の発現、（II）AHRリガンド結合ドメインを含むキメラまたは切り捨てられたAHRタンパク質との競合と（III）治療により有意に減少しました。AHRアンタゴニストのアルファナフソフラボンを使用します。これらの結果は、CYP1A1酵素活性を欠く細胞に蓄積するCYP1A1基質が、AH受容体の内因性活性化の原因となるAHRリガンドであることを示唆しています。

The ligand-activated aromatic hydrocarbon receptor (AHR) dimerizes with the AHR nuclear translocator (ARNT) to form a functional complex that transactivates expression of the cytochrome P-450 CYP1A1 gene and other genes in the dioxin-inducible [Ah] gene battery. Previous work from this laboratory has shown that the activity of the CYP1A1 enzyme negatively regulates this process. To study the relationship between CYP1A1 activity and Ah receptor activation we used CYP1A1-deficient mouse hepatoma c37 cells and CYP1A1- and AHR-deficient African green monkey kidney CV-1 cells. Using gel mobility shift and luciferase reporter gene expression assays, we found that c37 cells that had not been exposed to exogenous Ah receptor ligands already contained transcriptionally active AHR-ARNT complexes, a finding that we also observed in wild-type Hepa-1 cells treated with Ellipticine, a CYP1A1 inhibitor. In CV-1 cells, transient expression of AHR and ARNT leads to high levels of AHR-ARNT-dependent luciferase gene expression even in the absence of an agonist. Using a green fluorescent protein-tagged AHR, we showed that elevated reporter gene expression correlates with constitutive nuclear localization of the AHR. Transcriptional activation of the luciferase reporter gene observed in CV-1 cells is significantly decreased by (i) expression of a functional CYP1A1 enzyme, (ii) competition with chimeric or truncated AHR proteins containing the AHR ligand-binding domain, and (iii) treatment with the AHR antagonist alpha-naphthoflavone. These results suggest that a CYP1A1 substrate, which accumulates in cells lacking CYP1A1 enzymatic activity, is an AHR ligand responsible for endogenous activation of the Ah receptor.