フィブロネクチン支援レトロウイルス遺伝子移動のヒトCD34+造血細胞への最適化

組換えフィブロネクチン（FN）断片の特定の接着ドメインでレトロウイルスと標的細胞を共局在化することにより、造血幹および前駆細胞への効率的なレトロウイルス遺伝子移動を達成できます。この論文では、ヒトCD34+細胞のこの技術をさらに最適化します。組換えFN CH-296でコーティングされたプレート上のレトロウイルス媒介遺伝子導入におけるサイトカインプレスティミューションの役割を調査することで、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）の変調された末梢血（PB）CD34+細胞の事前症状が効率的な末梢末梢血（PB）の末梢血（PB）型細胞が不可欠であることが明らかになりました。クローン原性細胞への遺伝子移動。CH-296でのレトロウイルス感染前に、幹細胞因子（SCF）、G-CSF、および巨核球成長および発達因子（MGDF）を組み合わせて、PB CD34+細胞に40時間前に発生することによって発生しました。驚くべきことに、CH-296の存在下で一次CD34+ PB細胞をレトロウイルスとサイトカインに長期に同時に曝露すると、遺伝子導入効率が低下しました。サイトカインの事前に刺激されたCD34+骨髄（BM）細胞への遺伝子移動は、組換えFNフラグメントCH-296のコーティング濃度の増加によって影響を受けませんでした。上清に存在する粒子は、CH-296コーティングされたプレート上のCD34+ BM細胞の形質導入の制限因子ではありませんでした。Polycationポリブレンは、CH-296の存在下で造血細胞の効率的な形質導入には必要ありませんでした。さらに、Proadingと呼ばれる上清を含むレトロウイルスへのCH-296の繰り返し曝露を使用して、CH-296に結合したレトロウイルス粒子の量を濃縮できることを実証しました。これらの発見は、BMまたはG-CSF変形したPB CD34+細胞の最大68％を標的とし、CD34+ CD38-/DIM PB細胞の最大17％を遺伝子組み換えることができる、単純で短い臨床的に適用可能な形質導入プロトコルを確立します。

Efficient retroviral gene transfer into hematopoietic stem and progenitor cells can be achieved by co-localizing retrovirus and target cells on specific adhesion domains of recombinant fibronectin (FN) fragments. In this paper, we further optimize this technology for human CD34+ cells. Investigating the role of cytokine prestimulation in retrovirus-mediated gene transfer on plates coated with the recombinant FN CH-296 revealed that prestimulation of granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF)-mobilized peripheral blood (PB) CD34+ cells was essential to achieve efficient gene transfer into clonogenic cells. The highest gene transfer occurred by prestimulating PB CD34+ cells for 40 hr with a combination of stem cell factor (SCF), G-CSF, and megakaryocyte growth and development factor (MGDF) prior to retroviral infection on CH-296. Surprisingly, a prolonged simultaneous exposure of primary CD34+ PB cells to retrovirus and cytokines in the presence of CH-296 lowered the gene transfer efficiency. Gene transfer into cytokine prestimulated CD34+ bone marrow (BM) cells was not influenced by increasing the coating concentrations of a recombinant FN fragment, CH-296, nor was it adversely influenced by increasing the number of CD34+ target cells, suggesting that the amount of retroviral particles present in the supernatant was not a limiting factor for transduction of CD34+ BM cells on CH-296-coated plates. The polycation Polybrene was not required for efficient transduction of hematopoietic cells in the presence of CH-296. Furthermore, we demonstrated that repeated exposure of CH-296 to retrovirus containing supernatant, called preloading, can be employed to concentrate the amount of retroviral particles bound to CH-296. These findings establish a simple and short clinically applicable transduction protocol that targets up to 68% of BM or G-CSF-mobilized PB CD34+ cells and is capable of genetically modifying up to 17% of CD34+CD38-/dim PB cells.