ヒストン-GFP融合タンパク質は、生きている哺乳類細胞における染色体ダイナミクスの敏感な分析を可能にします

背景：癌細胞における癌遺伝子の増幅は、しばしば二重微ある染色体（DMS）と呼ばれるペアのacentricクロマチン体によって媒介されます。有糸分裂中の娘細胞への不均一な分布。DMの分離を制御するメカニズムは調査が困難でしたが、生細胞におけるDMの直接的な視覚化は、通常の染色体よりもはるかに小さいため、排除されています。生細胞で染色体のダイナミクスを観察するための非常に敏感な方法を開発することにより、DMSを視覚化しました。 結果：ヒトヒストンH2B遺伝子を、equorea victoriaの緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードする遺伝子に融合し、ヒトHeLa細胞にトランスフェクトして、H2B-GFPを構成する安定した系統を生成しました。H2B-GFP融合タンパク質は、細胞周期の進行に影響を与えることなくヌクレオソームに組み込まれました。共焦点顕微鏡を使用して、H2B-GFPは有糸分裂染色体と間期クロマチンの両方の高解像度イメージングを可能にし、後者は生細胞のさまざまなクロマチン凝縮状態を明らかにしました。H2B-GFPを使用して、生きている癌細胞のDMSを直接観察することができます。DMはしばしば段階中にクラスター化され、娘の染色体を分離する間に染色体「橋」を形成する可能性があります。サイトカインズはDMブリッジを切断し、娘細胞へのDMSの不均一な分布をもたらしました。 結論：H2B-GFPシステムは、核および染色体構造を妥協することなく、DMSを含む染色体の高解像度イメージングを可能にし、娘細胞への非対称分布に寄与する有糸分裂細胞におけるDMSの特徴的なクラスタリング挙動を明らかにしました。

BACKGROUND: The amplification of oncogenes in cancer cells is often mediated by paired acentric chromatin bodies called double minute chromosomes (DMs), which can accumulate to a high copy number because of their autonomous replication during the DNA synthesis phase of the cell cycle and their subsequent uneven distribution to daughter cells during mitosis. The mechanisms that control DM segregation have been difficult to investigate, however, as the direct visualization of DMs in living cells has been precluded because they are far smaller than normal chromosomes. We have visualized DMs by developing a highly sensitive method for observing chromosome dynamics in living cells. RESULTS: The human histone H2B gene was fused to the gene encoding the green fluorescent protein (GFP) of Aequorea victoria and transfected into human HeLa cells to generate a stable line constitutively expressing H2B-GFP. The H2B-GFP fusion protein was incorporated into nucleosomes without affecting cell cycle progression. Using confocal microscopy, H2B-GFP allowed high-resolution imaging of both mitotic chromosomes and interphase chromatin, and the latter revealed various chromatin condensation states in live cells. Using H2B-GFP, we could directly observe DMs in living cancer cells; DMs often clustered during anaphase, and could form chromosomal 'bridges' between segregating daughter chromosomes. Cytokinesis severed DM bridges, resulting in the uneven distribution of DMs to daughter cells. CONCLUSIONS: The H2B-GFP system allows the high-resolution imaging of chromosomes, including DMs, without compromising nuclear and chromosomal structures and has revealed the distinctive clustering behavior of DMs in mitotic cells which contributes to their asymmetric distribution to daughter cells.