翻訳開始因子2キナーゼGCN2による二量体化は、C末端リボソーム結合領域とプロテインキナーゼドメインでの相互作用によって媒介されます。

プロテインキナーゼGCN2は、リン酸化翻訳開始因子2によってアミノ酸に飢えた酵母細胞における転写活性化因子GCN4の翻訳を刺激します。リボソーム関連に必要な末端（C-Term）セグメントは、GCN2で特定されています。酵母2ハイブリッドアッセイ、共免疫沈降分析、およびin vitro結合アッセイを使用して、GCN2の異なる機能ドメイン間の物理的相互作用を調査しました。プロテインキナーゼ（PK）触媒ドメインの約3分の2を含むセグメントと、GCN2のCティーム領域を含む別のセグメントは、2ハイブリッドアッセイで自分自身と相互作用し、PKとC末端ドメインの両方を野生で抑制した可能性があります。酵母細胞抽出物からの型GCN2。さらに、in vitroで翻訳したPKおよびC期間セグメントは、それぞれ組換えグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）-PKおよびGST-C-ターム融合タンパク質にin vitroで特異的結合を示しました。野生型GCN2は、細胞抽出物からの全長lexA-GCN2融合タンパク質と共免疫沈降し、全長GCN2分子による二量体化の直接的な証拠を提供します。CタームまたはPKセグメントの削除は、それぞれGCN2-LEXA-GCN2複合体の収率を廃止または削減しました。これらの結果は、CタームドメインとPKドメインを含む自己相互作用によってGCN2が二量体化するというin vivoおよびin vitroの証拠を提供します。PKドメインは、シュードキナーゼ、HISRS、およびCタームドメインとのin vitro結合相互作用をペアワイズで示しました。さらに、HISRSドメインはCターム領域と相互作用しました。PKドメインとその隣接する調節領域とPKおよびCタームドメインを介した二量体化との間の物理的相互作用は、GCN2キナーゼ活性をアミノ酸に飢えた細胞に制限する上で重要な役割を果たすことを提案します。

The protein kinase GCN2 stimulates translation of the transcriptional activator GCN4 in yeast cells starved for amino acids by phosphorylating translation initiation factor 2. Several regulatory domains, including a pseudokinase domain, a histidyl-tRNA synthetase (HisRS)-related region, and a C-terminal (C-term) segment required for ribosome association, have been identified in GCN2. We used the yeast two-hybrid assay, coimmunoprecipitation analysis, and in vitro binding assays to investigate physical interactions between the different functional domains of GCN2. A segment containing about two thirds of the protein kinase (PK) catalytic domain and another containing the C-term region of GCN2 interacted with themselves in the two-hybrid assay, and both the PK and the C-term domains could be coimmunoprecipitated with wild-type GCN2 from yeast cell extracts. In addition, in vitro-translated PK and C-term segments showed specific binding in vitro to recombinant glutathione S-transferase (GST)-PK and GST-C-term fusion proteins, respectively. Wild-type GCN2 could be coimmunoprecipitated with a full-length LexA-GCN2 fusion protein from cell extracts, providing direct evidence for dimerization by full-length GCN2 molecules. Deleting the C-term or PK segments abolished or reduced, respectively, the yield of GCN2-LexA-GCN2 complexes. These results provide in vivo and in vitro evidence that GCN2 dimerizes through self-interactions involving the C-term and PK domains. The PK domain showed pairwise in vitro binding interactions with the pseudokinase, HisRS, and C-term domains; additionally, the HisRS domain interacted with the C-term region. We propose that physical interactions between the PK domain and its flanking regulatory regions and dimerization through the PK and C-term domains both play important roles in restricting GCN2 kinase activity to amino acid-starved cells.