PMA処理MCF-7ヒト乳がん細胞におけるPKCデルタと活性SRCの関連

MCF-7細胞のホルボールエステル処理により、チロシンのリン酸化とPKCデルタの活性化が得られました。ただし、ウエスタンブロット分析とin vitro免疫補眼キナーゼアッセイにより、チロシンリン酸化PKCデルタと触媒活性PKCデルタの微分局在を検出しました。触媒活性PKCデルタは、チロシンリン酸化PKCデルタをサイトゾル画分に局在させ、触媒活性PKCデルタをTriton X-100溶媒溶解膜分画に濃縮しました。MCF-7細胞のホルボールエステル処理は、PKCデルタの共免疫沈降によりSRC免疫沈降物で証明されたSRC免疫沈降で証明されたSRC免疫沈降により、SRC免疫沈降により、反応性免疫沈降物の活性化により反応性の増加の増加の増加の増加のSRCの活性化で証明されたPKCデルタのin vivo関連性の両方を刺激しました。SRC抗体（クローン28）では、SRCキナーゼ活性の増加により、活性SRC（残基530で脱リン酸化）およびSRCおよびPKC Delta免疫沈降物のみを活性化します。私たちのデータは、PKCデルタの活性化因子/刺激依存性チロシンリン酸化を示す文献のレポートと一致していますが、我々のデータは、PKCデルタのチロシンリン酸化がキナーゼ活性に不可欠ではないことを示しています。これらの結果は、PKCデルタまたはSRCのいずれかの過剰発現がない場合、PKCデルタとアクティブSRCの間のin vivo関連を実証した最初の結果であり、SRCとPKC Deltaの生理機能への関連性をサポートします。

Phorbol ester treatment of MCF-7 cells led to the tyrosine phosphorylation and activation of PKC delta. However, through Western blot analysis and in vitro immunecomplex kinase assays, we detected a differential localization of tyrosine-phosphorylated PKC delta and catalytically active PKC delta. Catalytically active PKC delta was concentrated in Triton X-100 solubilized-membrane fractions while tyrosine-phosphorylated PKC delta was localized to the cytosol fraction. Phorbol ester treatment of MCF-7 cells stimulated both the time-dependent in vivo association of Src with PKC delta, evidenced in Src immunoprecipitates by the co-immunoprecipitation of PKC delta, and activation of Src, evidenced in Src immunoprecipitates as an increase in reactivity with a Src antibody (clone 28) reactive only with active Src (dephosphorylated on residue 530) and in Src and PKC delta immunoprecipitates by an increase in Src kinase activity. While our data are consistent with reports in the literature showing the activator/stimulus-dependent tyrosine phosphorylation of PKC delta, our data show that the tyrosine phosphorylation of PKC delta is not essential for kinase activity. These results are the first to demonstrate an in vivo association between PKC delta and active Src in the absence of over-expression of either PKC delta or Src, and support the association of Src and PKC delta towards a physiological function.