ガラクトースオキシダーゼのメカニズムのプローブとしての運動同位体効果

ガラクトースオキシダーゼ（GO）は、活性部位の銅に調整されたフリーラジカルを含む酵素を含むラジカル結合銅オキシダーゼのファミリーのメンバーです。触媒において、酸化状態（Cu（II）を含むユニークなシステニル - チロシンラジカルを含む）と、アルコールへの2電子酸化を触媒するため、還元状態（シングレシュタイニル - チロシンを含むCu（I）を含む）の間のサイクルがあります。アルデヒドとその後のO2のH2O2への減少。GO触媒のために、ラジカル中間体を含むPing-Pongメカニズムが提案されています。以前の定常状態の速度論的研究では、6-ヒドロキシメチル基からのプロS水素の立体特異的抽象化を含むプロセスである、基質酸化に起因する7-8のKIEが実証されています。迅速な速度論的方法を使用して、4度のGO基質の嫌気性還元を測定し、H2OとD2Oの両方で6プロチオおよび6-デュテロ基質を使用して酵素モニタルの離職実験を実施しました。km未満の濃度では、タンパク質基質酸化の見かけの2次速度定数、Kredは1.59 x 10（4）M-1 S-1でしたが、湿生基質のそれは7.50 x 10（2）M-1 sでした-1、21.2のKie。低ガラクトース濃度での酸素消費量の定常状態測定は、1-O-メチル-6、6'-di- [2H] -alpha-の酸化のための異常に大きな同位体効果（kH/kd = 22.5 +/- 2）を明らかにしています。d-ガラクトピラノシド、および酸素半反応が触媒において速度制限である高ガラクトース濃度で、O2をH2O2に減少させるための驚くほど大きなKIE（kH/kd = 8 +/- 1）。これらの測定値のいずれにも検出可能な溶媒同位体効果（<5％）はありません。これは、速度論的に有意なステップに関与する交換可能なプロトンがなく、ガラクトースから除去された水素原子が触媒中に溶媒に失われないことを示しています。代わりに、酸素とのその後の反応の速度制限ステップにも参加します。km未満の濃度では、タンパク質成績酸化の見かけの2次速度定数（KRED = 1.5 x 10（4）M-1 S-1）およびO2還元（Kox = 8 x 10（6）M-1 S-1）定常状態の酸素電極と酵素監視された代謝回転の両方で測定から推定されています。これは、上記の嫌気性研究と完全に一致しています。我々の結果は、O2の生理学的濃度との非常に速い反応により、還元ステップが実用的な基質濃度でほぼ完全に速度制限されていることと一致して、定常状態の離職中に酵素が本質的に完全に酸化されていることを示しています。全体として、触媒反応はピンポンメカニズムと一致しています。3つの方法すべての酵素の減少に関連する大きなKIEは、GOのために以前に提案されたラジカルメカニズムと一致して、速度決定ステップで活性部位チロシンラジカルによる水素原子ラジカル抽象化を反映するようです。低基質濃度で決定されたKIEは、定常状態の酸素消費測定から低基質濃度（基質の酸化が速度を決定する）で、4度の22.5から45度で13まで変化し、水素原子移動ステップに関与するトンネリングと一致しています。

Galactose oxidase (GO) is a member of the family of radical-coupled copper oxidases, enzymes containing a free radical coordinated to copper in the active site. In catalysis GO cycles between an oxidized state (comprising Cu(II) with a unique cysteinyl-tyrosine radical) and a reduced state (comprising Cu(I) with the singlet cysteinyl-tyrosine) as it catalyzes the two-electron oxidation of alcohols to aldehydes and the subsequent reduction of O2 to H2O2. A ping-pong mechanism involving radical intermediates has been proposed for GO catalysis. Previous steady-state kinetics studies have demonstrated a KIE of 7-8 that was attributed to substrate oxidation, a process involving the stereospecific abstraction of the pro-S hydrogen from the 6-hydroxymethyl group of galactose. We have used rapid kinetics methods to measure the anaerobic reduction of GO substrate at 4 degreesC and carry out enzyme-monitored turnover experiments using 6-protio and 6-deutero substrates, both in H2O and D2O. At concentrations below Km, the apparent second-order rate constant for protio-substrate oxidation, kred, was 1.59 x 10(4) M-1 s-1, while that for deuterated substrate was 7.50 x 10(2) M-1 s-1, a KIE of 21.2. Steady-state measurements of oxygen consumption at low galactose concentrations reveal an unusually large isotope effect (kH/kD = 22.5 +/- 2) for oxidation of 1-O-methyl-6, 6'-di-[2H]-alpha-d-galactopyranoside, and at high galactose concentrations, where the oxygen half-reaction is rate-limiting in catalysis, a surprisingly large KIE (kH/kD = 8 +/- 1) for the reduction of O2 to H2O2. There is no detectable solvent isotope effect (<5%) on any of these measurements. This shows that there are no exchangeable protons involved in any kinetically significant step and that the hydrogen atom removed from galactose is not lost to solvent during catalysis; instead, it also participates in the rate-limiting step of the subsequent reaction with oxygen. At concentrations below Km, apparent second-order rate constants for protio-substrate oxidation (kred = 1.5 x 10(4) M-1 s-1) and O2 reduction (kox = 8 x 10(6) M-1 s-1) have been estimated from measurements both by steady-state oxygen electrode and by enzyme-monitored turnover. This is completely consistent with the anaerobic studies mentioned above. Our results show that the enzyme is essentially fully oxidized while in steady-state turnover, consistent with the reduction step being nearly fully rate-limiting at practical substrate concentrations, due to the very fast reaction with physiological concentrations of O2. Overall, the catalytic reaction is in concordance with a ping-pong mechanism. The large KIE associated with reduction of the enzyme in all three methods appears to reflect hydrogen atom radical abstraction by the active site tyrosine radical in the rate-determining step, in agreement with the previously proposed radical mechanism for GO. The KIE determined at low substrate concentrations (where oxidation of substrate is rate determining) from steady-state oxygen consumption measurements, varies from 22.5 at 4 degreesC to 13 at 45 degreesC, consistent with tunneling being involved in the hydrogen atom transfer step.