サーモアナエロバクテリウム熱硫黄尿素産のシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼにおけるアルファアミラーゼおよびシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼの特異性を決定する因子の工学

澱粉分解酵素のアルファアミラーゼおよびシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ（CGTase）は、機能的および構造的に密接に関連しており、アルファアミラーゼの3つのドメイン（A、BおよびC）の3つのドメインと比較して、2つの追加ドメイン（DおよびEと呼ばれる）を含むCGTaseが含まれています。アミノ酸残基196（サーモアナエロバクテリウム熱硫黄尿症EM1 CGTase番号）は、活性部位の裂け目で支配的な位置を占めています。研究されたすべてのアルファアミラーゼは、この位置によりかさばる芳香族残基（TYRまたはPHE）を持つCGTaseとは対照的に、この位置に小さな残基（Gly、Leu、Ser、Thr、またはVal）を持っています。T. Thermosulfurigenes EM1のF196G変異体CgTaseの特性評価は、未知の理由で、F196G変異を除き、ドメインEおよびドメインDの一部が削除されたことを明らかにしました[変異F196G（Delta'DE）]。それにもかかわらず、これは、安定した活性変異体cGtaseタンパク質（62 kDa）の精製を妨げませんでした。変異タンパク質は、残基196の同一性の観点から、およびいくつかの追加のC末端構造を含むドメイン構造の観点から、アルファアミラーゼタンパク質によく似ていました。変異体は、最適な温度が大幅に低下することを示しました。変異F196Gのフレームシフト変異により、DEドメインを持つ19 kDaの別のタンパク質も生成されました。Mutant F196G（Delta'DE）は、生星結合Eドメインを欠くほとんどのアルファアミラーゼの状況と同様に、強く減少した生星結合能力を示しました。野生型CGTaseと比較して、環化、カップリング、および不均衡活性が変異体F196G（Delta'DE）で大幅に減少しましたが、糖化活性は2倍になり、CGTaseで報告された最高レベルに達しました。工業生産プロセス条件下では、野生型CGTaseは澱粉を35％シクロデキストリンと11％の線形オリゴ糖（グルコース、マルトース、マルトトリオース）に変換しましたが、変異体F196G（デルタ）はデンプンを21％シクロデキソトリンに、18％の線形オリゴサッチャチャージに変換しました。これらの生化学的特性は、CGTaseからアルファアミラーゼ特異性への明確なシフトを示しています。

The starch-degrading enzymes alpha-amylase and cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) are functionally and structurally closely related, with CGTases containing two additional domains (called D and E) compared to the three domains of alpha-amylases (A, B and C). Amino acid residue 196 (Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes EM1 CGTase numbering) occupies a dominant position in the active-site cleft. All alpha-amylases studied have a small residue at this position (Gly, Leu, Ser, Thr or Val), in contrast to CGTases which have a more bulky aromatic residue (Tyr or Phe) at this position, which is highly conserved. Characterization of the F196G mutant CGTase of T. thermosulfurigenes EM1 revealed that, for unknown reasons, apart from the F196G mutation, domain E as well as a part of domain D had become deleted [mutant F196G(delta'DE)]. This, nevertheless, did not prevent the purification of a stable and active mutant CGTase protein (62 kDa). The mutant protein was more similar to an alpha-amylase protein in terms of the identity of residue 196, and in the domain structure containing, however, some additional C-terminal structure. The mutant showed a strongly reduced temperature optimum. Due to a frameshift mutation in mutant F196G, a separate protein of 19 kDa with the DE domains was also produced. Mutant F196G(delta'DE) displayed a strongly reduced raw-starch-binding capacity, similar to the situation in most alpha-amylases that lack a raw-starch-binding E domain. Compared to wild-type CGTase, cyclization, coupling and disproportionation activities had become drastically reduced in the mutant F196G(delta'DE), but its saccharifying activity had doubled, reaching the highest level ever reported for a CGTase. Under industrial production process conditions, wild-type CGTase converted starch into 35% cyclodextrins and 11% linear oligosaccharides (glucose, maltose and maltotriose), whereas mutant F196G(delta'DE) converted starch into 21% cyclodextrins and 18% into linear oligosaccharides. These biochemical characteristics indicate a clear shift from CGTase to alpha-amylase specificity.