DNAライゲーションの忠実度：オリゴヌクレオチドのライブラリの重合に基づく新しい実験的アプローチ

オリゴヌクレオチドの完全なライブラリは、M13MP18 SSDNAテンプレート上のThermus Thermophilus DNAリガーゼの基質として使用されました。17merプライマーを使用して、重合プロセスを開始しました。梯子の梯子は、ゲル電気泳動によって分析されました。Octa-、Nona、およびDecanucleotideライブラリを比較しました。非ヌクレオチドは重合に最適であり、最大15個のモノマーが結紮されました。取り込みの忠実度は、長さ12個のモノマーの28個のクローン（2268塩基）の非ヌクレオチドポリマーを配列決定することにより研究されました。結紮されたモノマーのうち、79％が正しい補完シーケンスでした。合計57（2.5％）の誤った塩基で、G.T、G.A、G.GおよびA.Gの不一致に強いバイアスがありました。ミスマッチのうち、86％が入ってくるオリゴヌクレオチドのプリンであることがわかった。そのうち71％はGでした。特定の9mer内およびこれらの9mer内の特定の位置でミスマッチのクラスタリングの証拠があります。最も頻繁な不一致は、オリゴヌクレオチドの5'末端にあり、その後に中央の位置が続きました。シーケンス選択は、ベースペアリングの相互作用だけでなく、リガーゼによって課されることをお勧めします。リガーゼは、私たちが提案する3 'から5'の方向に重合を導きます。これは、ストランドDNA複製の遅れにおけるその役割にリンクされています。

Complete libraries of oligonucleotides were used as substrates for Thermus thermophilus DNA ligase, on a M13mp18 ssDNA template. A 17mer primer was used to start a polymerisation process. Ladders of ligation products were analysed by gel electrophoresis. Octa-, nona- and decanucleotide libraries were compared. Nonanucleotides were optimum for polymerisation and up to 15 monomers were ligated. The fidelity of incorporation was studied by sequencing 28 clones (2268 bases) of nonanucleotide polymers, 12 monomers in length. Of the ligated monomers, 79% were the correct complementary sequence. In a total of 57 (2.5%) mispaired bases, there was a strong bias to G.T, G.A, G.G and A.G mismatches. Of the mismatches, 86% were found to be purines on the incoming oligonucleotide, of which 71% were G. There is evidence for clustering of mismatches within specific 9mers and at specific positions within these 9mers. The most frequent mismatches were at the 5'-terminus of the oligonucleotide, followed by the central position. We suggest that sequence selection was imposed by the ligase and not just by base pairing interactions. The ligase directs polymerisation in the 3' to 5' direction which we propose is linked to its role in lagging strand DNA replication.