組換えヒトレチノール結合タンパク質の繰り返し、天然のジスルフィド形成、および特性評価

ヒトレチノール結合タンパク質（RBP）は、レチノールの細胞取り込みと利用におけるその役割により、現在数多くの研究の対象となっているモノマー21-kDaタンパク質です。大腸菌でRBP遺伝子が過剰発現すると、凝集したRBPの包含体が細胞に見られます。これらの包含体は、10 mM DTTを含む5.0 M GDMCLで可溶化されます。RBPの再溶解は、4度の3 mMシステイン/0.3 mMシスチンで構成される酸化還元バッファーに変性し、RBPを還元することにより、ビタミンAの存在下で実行されます。イオン交換クロマトグラフィー（HPLC）は、SDS-PAGEおよびエレクトロスプレーMSによって示されるように、改良されたRBPを均一性に精製するために使用されます。改良されたRBPの天然構造は、ビタミンAと血漿タンパク質トランスシレチンに結合する能力によって確立されました。概説されているRBPの再構成により、50〜60％の全体の収量、つまり73 mgの大腸菌培養の純粋なRBP/Lが得られます。

Human retinol-binding protein (RBP) is a monomeric 21-kDa protein that is currently the subject of numerous studies owing to its role in the cellular uptake and utilization of retinol. When the RBP gene is overexpressed in Escherichia coli, inclusion bodies of aggregated RBP are found in the cells. These inclusion bodies are solubilized in 5.0 M GdmCl containing 10 mM DTT. Refolding of RBP is carried out in the presence of vitamin A by diluting denatured and reduced RBP into a redox refolding buffer consisting of 3 mM cysteine/0.3 mM cystine at 4 degreesC. Ion exchange chromatography (HPLC) is utilized to purify refolded RBP to homogeneity as demonstrated by SDS-PAGE and electrospray MS. The native structure of refolded RBP was established by its ability to bind to vitamin A and the plasma protein transthyretin. The reconstitution of RBP outlined within affords a 50-60% overall yield, i.e., 73 mg of pure RBP/L of E. coli culture.