バクテリオファージT4ヘッドとプロヘッド内で標的とする外来タンパク質の活動：パッケージ化されたDNA構造への影響

ファージ由来の発現、包装、および加工（PEPP）システムを使用して、外来タンパク質をバクテリオファージカプシドに標的として、カプシド環境とパッケージDNAの構造をプローブしました。活性の必要性を最小限に抑えた小さなタンパク質が選択されました。ブドウ球菌ヌクレアーゼ（SN）および緑色蛍光タンパク質（GFP）を選択しました。これらのタンパク質は、IPIII（内部タンパク質III）融合またはCTS（CapSIDターゲティングシーケンス）融合によってT4ヘッドに標的とされました。以前の研究で特定されたIPIIIのN末端10アミノ酸残基コンセンサスCTによって、外来タンパク質がT4を標的とするという追加の証拠が提供されています。融合タンパク質は、プラスミドからの発現または融合遺伝子を運ぶ組換えファージから生成することにより、宿主細菌内で産生されました。パッケージ化された融合タンパク質CTS IPIII SN、CTS IPIII TSN、CTS IPIII GFP、CTS IPIII TGFP、およびCTS GFP。頭部成熟中のGP21は、カプシド中の活性を示すことが観察されます。ヘッド内のSN活性は、ファージの生存率の喪失と、実行可能なファージをCa2+でインキュベートする場合のゲル電気泳動によって視覚化された消化されたゲノムDNAパターンによって実証されます。緑色の蛍光ファージは、30度以下で生成されたGFPを包装する直後に生成され、CSCL精製後470 nmの光の下で緑色蛍光を与え続けます。非蛍光GFP融合は、37度の細菌で生成され、これらのタンパク質がパッケージされたファージは、4℃で数ヶ月間インキュベートした後、蛍光状態を達成します。蛍光分光法で分析されたGFPパッケージファージとプロヘッドは、成熟した頭とDNA-Empty ProheadパッケージがGFP融合タンパク質の同一の数を示していることを示しています。カプシド化されたGFPとSNを細菌に注入し、細胞内活性を急速に示すことができます。in vivo sn in in capsidated DNAの消化は、ゲル分析によりDNA断片の興味深いパターンを与えます。主に160 bpの倍数の繰り返しパターンは、ヌクレオソーム消化のはしごを連想させます。力価の損失は、ヘッドごとにパッケージ化されたSNの範囲</= 10〜200分子の範囲で不変であり、融合のIPIII部分からのSNのタンパク質分解切断とは無関係であり、不連続なパッケージDNA構造を支持しています。B-form DNAのロッドは消化から保護されていると想定できますが、曲がったDNAまたはキンク化されたDNAは拡散性SNの影響を受けやすくなります。このような不連続なパッケージDNA構造は、多くの証拠によってファージT4に好まれています。

The phage-derived expression, packaging, and processing (PEPP) system was used to target foreign proteins into the bacteriophage capsid to probe the intracapsid environment and the structure of packaged DNA. Small proteins with minimal requirements for activity were selected, staphylococcal nuclease (SN) and green fluorescent protein (GFP). These proteins were targeted into the T4 head by means of IPIII (internal protein III) fusions or CTS (capsid targeting sequence) fusions. Additional evidence is provided that foreign proteins are targeted into T4 by the N-terminal ten amino acid residue consensus CTS of IPIII identified in previous work. Fusion proteins were produced within host bacteria by expression from plasmids or by produc tion from recombinant phage carrying the fusion genes. Packaged fusion proteins CTS IPIII SN, CTS IPIII TSN, CTS IPIII GFP, CTS IPIII TGFP, and CTS GFP, where [symbol: see text] indicates a linkage peptide sequence Leu(Ile)-N-Glu cleaved by the T4 head morphogenetic proteinase gp21 during head maturation, are observed to exhibit intracapsid activity. SN activity within the head is demonstrated by loss of phage viability and by digested genomic DNA patterns visualized by gel electrophoresis when viable phage are incubated in Ca2+. Green fluorescent phage result immediately after packaging GFP produced at 30 degreesC and below, and continue to give green fluorescence under 470 nm light after CsCl purification. Non-fluorescent GFP-fusions are produced in bacteria at 37 degreesC, and phage packaged with these proteins achieve a fluorescent state after incubation for several months at 4 degreesC. GFP-packaged phage and proheads analyzed by fluorescence spectroscopy show that the mature head and the DNA-empty prohead package identical numbers of GFP-fusion proteins. Encapsidated GFP and SN can be injected into bacteria and rapidly exhibit intracellular activity. In vivo SN digestion of encapsidated DNA gives an intriguing pattern of DNA fragments by gel analysis, predominantly a repeat pattern of 160 bp multiples, reminiscent of a nucleosome digestion ladder, This quasi-limit DNA digestion pattern, reached >100-fold more slowly than the loss of titer, is invariant over a range </=10 to 200 molecules of SN packaged per head, and independent of proteolytic cleavage of SN from the IPIII portion of the fusion, favoring a discontinuous packaged DNA structure. Rods of B-form DNA could be envisioned as protected from digestion, whereas bent or kinked DNA would be more susceptible to the diffusible SN. Such discontinuous packaged DNA structures are favored for phage T4 by a number of lines of evidence.