HeLa細胞におけるエンドサイトーシス輸送に対するBafilomycin A1およびノコダゾールの影響：ウイルス性のない感染と感染への影響

液胞プロトンATPaseの特異的阻害剤であるBafilomycin A1（BAF）は、ウイルスの発生のための低エンドソームpHの要件を実証するために一般的に採用されています。ただし、特定の細胞型では、BAFは、エンドサイトーシス材料の初期から後期のエンドサイトーシスコンパートメントの輸送にも影響します。ウイルス感染の初期イベントを研究するために頻繁に使用されるHELA細胞のエンドサイトーシス経路を特徴付けるために、さまざまな液相マーカーとともに35S標識ヒトライノウイルス血清型2（HRV2）を使用しました。これらのビリオンは、受容体を介したエンドサイトーシスを介して取り込まれ、<5.6のpHでC抗原粒子に立体構造変化を起こし、ゲノムRNAの放出をもたらし、最終的に感染します（E. Prchla、E。Kuechler、D。Blaas、およびR. Fuchs、J。Virol。68：3713-3723、1994）。蛍光顕微鏡検査と自由流量電気泳動（FFE）によるミクロソームの細胞内分別によって明らかにされたように、BAFは初期エンドソームのすべてのマーカーの輸送を逮捕します。対照的に、微小管破壊剤ノコダゾールは、初期および後期エンドソームの中間のコンパートメントであるエンドソーム担体小胞（ECV）にマーカーを蓄積することにより輸送を阻害することがわかった。したがって、HRV2のリソソーム分解は抑制されましたが、その立体構造の変化と感染性はこの薬の影響を受けませんでした。FFEによるノコダゾールの存在下でのHRV2および液相マーカーの細胞内分布の分析により、ノコダゾールの非存在下でのコントロールインキュベーションとの差は明らかになりませんでした。したがって、ECVおよび後期エンドソームは、同一の電気泳動移動度、および血管内pHが5.6未満であり、HRV2の拡張を許可しています。バフィロマイシンは低エンドソームpHを消散させるだけでなく、HELA細胞の初期エンドソームから後期エンドソームへの輸送をブロックするため、ウイルス感染に対するその阻害効果は、一部が、服用に不可欠な成分を欠く可能性のある初期エンドソームのウイルスの捕獲に一部起因する可能性があります。したがって、バフィロマイシンによるウイルスの抑制の阻害は、低いpH要件のみを示すために取られることはできません。

Bafilomycin A1 (baf), a specific inhibitor of vacuolar proton ATPases, is commonly employed to demonstrate the requirement of low endosomal pH for viral uncoating. However, in certain cell types baf also affects the transport of endocytosed material from early to late endocytic compartments. To characterize the endocytic route in HeLa cells that are frequently used to study early events in viral infection, we used 35S-labeled human rhinovirus serotype 2 (HRV2) together with various fluid-phase markers. These virions are taken up via receptor-mediated endocytosis and undergo a conformational change to C-antigenic particles at a pH of <5.6, resulting in release of the genomic RNA and ultimately in infection (E. Prchla, E. Kuechler, D. Blaas, and R. Fuchs, J. Virol. 68:3713-3723, 1994). As revealed by fluorescence microscopy and subcellular fractionation of microsomes by free-flow electrophoresis (FFE), baf arrests the transport of all markers in early endosomes. In contrast, the microtubule-disrupting agent nocodazole was found to inhibit transport by accumulating marker in endosomal carrier vesicles (ECV), a compartment intermediate between early and late endosomes. Accordingly, lysosomal degradation of HRV2 was suppressed, whereas its conformational change and infectivity remained unaffected by this drug. Analysis of the subcellular distribution of HRV2 and fluid-phase markers in the presence of nocodazole by FFE revealed no difference from the control incubation in the absence of nocodazole. ECV and late endosomes thus have identical electrophoretic mobilities, and intraluminal pHs of <5.6 and allow uncoating of HRV2. As bafilomycin not only dissipates the low endosomal pH but also blocks transport from early to late endosomes in HeLa cells, its inhibitory effect on viral infection could in part also be attributed to trapping of virus in early endosomes which might lack components essential for uncoating. Consequently, inhibition of viral uncoating by bafilomycin cannot be taken to indicate a low pH requirement only.