サイクリン依存性キナーゼ阻害剤オロモウシンおよびロスコビチンは、CDK2キナーゼ活性の特異的阻害により、G1相でヒト線維芽細胞を停止します

サイクリン依存性キナーゼ（CDK）阻害剤オロモウシンとロスコビチンによって誘発される細胞周期停止の特異性と時間的位置を、正常なヒト線維芽細胞で調査しました。細胞周期への影響は、キナーゼ阻害剤スタウロスポリンによって誘導された効果と比較されました。これは、CDK2の上流に作用することにより初期G1相の正常細胞を阻止します。それらのin vitro活性と一致して、オロモウシンとロスコビチンは、関連する化合物イソオロモウシンではなく、G1相で用量依存性停止を誘導しました。CDK阻害剤の除去後、細胞はStaurosporine処理されたサンプルよりも速い速度論でS期に入るサイクル進行を再開しました。PCNA、サイクリンD1、およびサイクリンEの細胞レベルは、CDK阻害剤の影響を受けませんでした。対照的に、スタウロスポリンは、免疫細胞測定とウエスタンブロット分析によって決定されるように、これらのタンパク質のレベルを大幅に低下させました。サイクリンAは、CDK阻害剤で処理されたサンプルのG2 + Mコンパートメントに残っている一部の細胞でのみ検出可能でしたが、スタウロスポリンで処理したサンプルではありませんでした。網膜芽細胞腫タンパク質の過剰リン酸化型の有意な減少は、CDK阻害剤で処理したサンプルで発見されましたが、スタールスポリン治療サンプルでは低リン酸化型のみが観察されました。同時に、CDK2ではなくCDK2は、オロモウシンまたはロスコビチンで処理された細胞から免疫沈降した活性を著しく阻害した。これらの結果は、正常細胞では、CDK2キナーゼ活性がオロモウシンとロスコビチンの特定の標的であることを示唆しています。

The specificity and the temporal location of cell cycle arrest induced by the cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitors olomoucine and roscovitine were investigated in normal human fibroblasts. Effects on the cell cycle were compared with those induced by the kinase inhibitor staurosporine, which arrests normal cells in early G1 phase by acting upstream of CDK2. Consistent with their in vitro activity, olomoucine and roscovitine, but not the related compound iso-olomoucine, induced a dose-dependent arrest in G1 phase. Following removal of CDK inhibitors, cells resumed cycle progression entering S phase with a kinetics faster than staurosporine-treated samples. Cellular levels of PCNA, cyclin D1, and cyclin E were not affected by the CDK inhibitors. In contrast, staurosporine significantly reduced the levels of these proteins, as determined by immunocytometry and Western blot analysis. Cyclin A was detectable only in some cells remaining in the G2 + M compartment of samples treated with CDK inhibitors, but not in samples treated with staurosporine. Significant reduction in the hyperphosphorylated forms of retinoblastoma protein was found in samples treated with CDK inhibitors, while only hypophosphorylated forms were observed in staurosporine-treated samples. Concomitantly, CDK2, but not CDK4, activity immunoprecipitated from cells treated with olomoucine or roscovitine was markedly inhibited. These results suggest that in normal cells, CDK2 kinase activity is the specific target of olomoucine and roscovitine.