トリオースリン酸イソメラーゼの機構におけるプロトン移動

トリオリン酸イソメラーゼ（TIM）は、ジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）およびグリセルアルデヒド3-リン酸（GAP）の可逆的な相互変換を触媒し、DHAPおよびNETRAL his-95のC1からC1からPRO-Rプロトンを除去し、副強化グループのカルボニルグループのポラリゼーションを除去します。。TIM反応中、DHAPのC1からのPro-Rトリチウムの約2％が保存されており、GAPのC2に登場します[Nickbarg、E。B.、およびKnowles、J。R.（1988）Biochemistry 27、5939]。「古典的な」メカニズムでは、中間状態でGLU-165から溶媒と溶媒とPRO-Rトリチウム交換の98％が交換され、残りの2％はGLU-165で同じ基質分子のC2に転送されます。したがって、このトリチウムの分子内移動は、DHAP濃度に依存しないと予測されています。GLU-165とエネディオール中間体の類似体の1-OHの間の強い水素結合のNMR検出に基づいて[Harris、T。K.、Abeygunawardana、C。、およびMildvan、A。S.（1997）Biochemistry 36、14661]、GLU-165がDHAPのC1からエネディオールのO2にプロトンを透過し、その後エネディオールのO1から製品ギャップのC2に移動するTIMの「Criss-Cross」メカニズムを提案しました。Pro-Rプロトンは、Criss-CrossメカニズムではC2の代わりにO2に転送されるため、基質から製品への標識の分子内移動は発生することは予想されません。ただし、ラベルがO2からタンパク質上のグループに交換し、その後のターンオーバーでギャップに移された場合、標識の分子間移動が発生する可能性があります。交差点メカニズムにおける分子間トリチウム移動の程度は、DHAP濃度に依存すると予測されます。トリチウム移動の程度は、PRO-R位置で高度に硬化したDHAPを使用した初期DHAP濃度の関数として研究されました。ギャップへの50％の変換で、三段階のトリチウム移動挙動が見つかりました。フェーズ1の場合、0.03〜0.3 mM DHAPの場合、1.19 +/- 0.03％のトリチウム移動の一定の範囲が発生しました。フェーズ2の場合、0.3〜1.0 mm DHAPでは、DHAP濃度の関数として2.17 +/- 0.15％に徐々に増加しました。フェーズ3の場合、1.0〜7.0 mm DHAPでは、移動の程度は1.68 +/- 0.17％にわずかに減少しました。分子間同位体伝達の直接テストでは、[1（r）-d、13c3] DHAPおよび13c枯渇[1（r）-H、12c3] DHAPを二重に標識した[1（r）-H、12c3] DHAPを合成し、等量で混合し、1 mmでインキュベートしました。TIM、GAP Dehydrogenase、NAD+、および3-ホスホグリセリ酸への50％の変換が発生するまでの総DHAPが発生しました。安定した3-ホスホグリセル酸製品のエレクトロスプレーイオン化質量スペクトル分析[13C3] DHAPから13C3製品への分子内D移動の1.4 +/- 0.4％の範囲が検出されましたが、D of Dの分子間移動（</= 0.02％）はありません。[13C3] 12C3製品へのDHAP。したがって、基質から生成物への水素の完全な移動は分子内であり、野生型TIMの断毒メカニズムに対する直接的なサポートは提供されません。初期DHAP濃度の増加に伴う分子内同位体移動の程度の増加は、この二量体酵素のサイトサイト相互作用を示しています。古典的なメカニズムによるC2への移動の間に、または標識間移動が発生しない断片的な交差メカニズムによるO2への抽象化されたプロトンの分配。

Triosephosphate isomerase (TIM) catalyzes the reversible interconversion of dihydroxyacetone phosphate (DHAP) and glyceraldehyde 3-phosphate (GAP), with Glu-165 removing the pro-R proton from C1 of DHAP and neutral His-95 polarizing the carbonyl group of the substrate. During the TIM reaction, approximately 2% of the pro-R tritium from C1 of DHAP is conserved and appears at C2 of GAP [Nickbarg, E. B., and Knowles, J. R. (1988) Biochemistry 27, 5939]. In the "classical" mechanism, 98% of the pro-R tritium exchanges with solvent from Glu-165 at the intermediate state and the remaining 2% is transferred by Glu-165 to C2 of the same substrate molecule. This intramolecular transfer of tritium is therefore predicted to be independent of DHAP concentration. On the basis of NMR detection of a strong hydrogen bond between Glu-165 and the 1-OH of an analogue of the enediol intermediate [Harris, T. K., Abeygunawardana, C., and Mildvan, A. S. (1997) Biochemistry 36, 14661], we have suggested a "criss-cross" mechanism for TIM in which Glu-165 transfers a proton from C1 of DHAP to O2 of the enediol, and subsequently from O1 of the enediol to C2 of the product GAP. Since the pro-R proton is transferred to O2 instead of C2 in the criss-cross mechanism, no intramolecular transfer of label from substrate to product would be expected to occur. However, intermolecular transfer of label could occur if the label exchanges from O2 into a group on the protein and is transferred to GAP in subsequent turnovers. The extent of intermolecular tritium transfer in the criss-cross mechanism would be predicted to be dependent on DHAP concentration. The extent of tritium transfer was studied as a function of initial DHAP concentration using DHAP highly tritiated at the pro-R position. At 50% conversion to GAP, triphasic tritium transfer behavior was found. For phase 1, between 0.03 and 0.3 mM DHAP, a constant extent of tritium transfer of 1.19 +/- 0.03% occurred. For phase 2, between 0.3 and 1.0 mM DHAP, the extent of transfer progressively increased as a function of DHAP concentration to 2.17 +/- 0.15%. For phase 3, between 1.0 and 7.0 mM DHAP, the extent of transfer slightly decreased to 1.68 +/- 0.17%. In a direct test for intermolecular isotope transfer, doubly labeled [1(R)-D, 13C3]DHAP and 13C-depleted [1(R)-H,12C3]DHAP were synthesized, mixed in equal amounts, and incubated at 1 mM total DHAP with TIM, GAP dehydrogenase, NAD+, and arsenate until 50% conversion to 3-phosphoglycerate occurred. Electrospray ionization mass spectral analysis of the stable 3-phosphoglycerate product detected an extent of 1.4 +/- 0.4% of intramolecular D transfer from [13C3]DHAP to the 13C3 product, but no intermolecular transfer (</=0.02%) of D from [13C3]DHAP to the 12C3 product. Hence, the entire transfer of hydrogen from substrate to product is intramolecular, providing no direct support for the criss-cross mechanism in wild-type TIM. The increase in the extent of intramolecular isotopic transfer with increasing initial DHAP concentration indicates site-site interaction in this dimeric enzyme which either (i) slows proton exchange with solvent from Glu-165 at the intermediate state in the classical mechanism or (ii) alters the partitioning of the abstracted proton between transfer to C2 by the classical mechanism or to O2 by the criss-cross mechanism in which no intermolecular transfer of label occurs.