タンパク質ホスファターゼ-1ターゲティングサブユニットにおけるグリコーゲン結合のための保存されたドメイン

タンパク質ホスファターゼ-1（PP1）の骨格筋グリコーゲン結合サブユニット（GM）は、グリコーゲンにPP1触媒サブユニット（PP1C）をつなぎ、グリコーゲンシンセーゼの除去症を促進するタンパク質のファミリーの創設メンバーです。疎水性シーケンス（ここではVFVモチーフと呼ばれます）は、GM、肝臓サブユニットGL、および広く発現したサブユニット、PTG、R5、およびU5の間で保存されています。この研究では、グリコーゲンとPP1Cへの結合におけるこのVFVモチーフの役割を分析しました。GM（GST-GM（1-240））のN末端ドメインと、両方とも共沈降アッセイでグリコーゲンに結合したフル長いR5タンパク質（GST-R5）を備えたグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）融合。対照的に、GST自体はグリコーゲンに結合しませんでした。GST-GM（1-240）の単一残基置換、F155Aは、グリコーゲン結合を40％減少させました。二重残基置換V150A/F155AおよびF155A/V159Aは、グリコーゲン結合の大幅な減少（60-70％）をもたらし、これらの疎水性残基がタンパク質グリコーゲンの相互作用に影響を与えたことを示しました。野生型およびV150A/ F155A融合タンパク質は、トリプシンによって同じ速度で同じサイズの断片に消化されました。さらに、プルダウンまたは遠心のアッセイで、野生型および変異GST-GMタンパク質、およびGST-R5結合等価PP1C。これらの結果は、変異した融合タンパク質による全体的な三次構造の保持を示し、グリコーゲンとPP1C結合は互いに独立していることを示しました。VFVモチーフを含むR5の68残基セグメントは、GSTに融合したときにグリコーゲン結合を生成するのに十分でした。このモチーフは、細菌および真菌の澱粉代謝酵素にあり、おそらくグリコーゲンと澱粉を結合するための機能的ドメインとして進化中に保存されてきました。

The skeletal muscle glycogen-binding subunit (GM) of protein phosphatase-1 (PP1) is the founding member of a family of proteins that tether the PP1 catalytic subunit (PP1C) to glycogen and promote the dephosphorylation of glycogen synthase. A hydrophobic sequence (called here the VFV motif) is conserved among GM, the liver subunit GL, and the widely expressed subunits, PTG, R5 and U5. This study analyzed the role of this VFV motif in binding to glycogen and PP1C. Glutathione S-transferase (GST) fusions with the N-terminal domain of GM (GST-GM(1-240)) and with the full length R5 protein (GST-R5) both bound to glycogen in a co-sedimentation assay. In contrast, GST itself did not bind to glycogen. A single residue substitution in GST-GM(1-240), F155A, reduced glycogen binding by 40%. Double residue substitutions V150A/F155A and F155A/V159A resulted in greater reductions (60-70%) in glycogen binding, showing these hydrophobic residues influenced the protein-glycogen interaction. The wild type and V150A/ F155A fusion proteins were digested by trypsin into the same sized fragments at the same rate. Furthermore, the wild type and mutated GST-GM proteins as well as GST-R5 bound equivalent amounts of PP1C, in either pull-down or far-Western assays. These results demonstrated retention of overall tertiary structure by the mutated fusion proteins, and indicated that glycogen and PP1C binding are independent of one another. A 68 residue segment of R5 encompassing the VFV motif was sufficient to produce glycogen binding when fused to GST. This motif, that is in bacterial and fungal starch metabolizing enzymes, probably has been conserved during evolution as a functional domain for binding glycogen and starch.