アルキル化によるシステイン残基の修飾ペプチドマッピングとタンパク質識別のツール

質量分析ペプチドマッピングは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Page）によって分離されたタンパク質の迅速な同定のための確立された手法となっていますが、同定手順の結果は曖昧な場合があります。このような曖昧さは、混合物として分離されたタンパク質、または非常に少量のタンパク質のみが分離されている場合、ますます一般的になります。識別手順の品質は、ゲルから抽出されたペプチドの数を増やすことで改善できます。ここでは、ページごとに分離されたタンパク質のマトリックス支援レーザー脱着/イオン化時間MS）ペプチドマッピングのマトリックス支援レーザー脱着/イオン化時間（MALDI-TOF MS）の最大カバレッジを確保するために、システインアルキル化が必要であることを示します。記載されている手順では、電気泳動中のアクリルアミド付加物の臨時形成を避けるために、電気泳動の前にアルキル化を実施しました。このようにして、3つの異なるアルキル化試薬（4-ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、アクリルアミド）で均一なアルキル化が得られました。システインアルキル化は、システイン含有ペプチドの同定のためのツールとしても使用されました。非標識アクリルアミドとデュートリウム標識アクリルアミド（[2,3,3'-D3]アクリルアミド）の1：1混合物を使用して、関心のあるタンパク質を電気泳動分離前にアルキル化しました。得られたタンパク質バンドのトリプシン消化によって生成されたペプチド混合物は、MALDI-TOF MSによって分析され、ペプチドのシステイン含有量は同位体分布から推測されました。システイン含有量情報は容易に得られ、タンパク質同定プロセスを改善するために使用されました。

Although mass spectrometric peptide mapping has become an established technique for the rapid identification of proteins isolated by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), the results of the identification procedure can sometimes be ambiguous. Such ambiguities become increasingly prevalent for proteins isolated as mixtures or when only very small amounts of the proteins are isolated. The quality of the identification procedure can be improved by increasing the number of peptides that are extracted from the gel. Here we show that cysteine alkylation is required to ensure maximal coverage in matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) peptide mapping of proteins isolated by PAGE. In the described procedure, alkylation was performed prior to electrophoresis to avoid the adventitious formation of acrylamide adducts during electrophoresis. In this way, homogeneous alkylation was obtained with three different alkylating reagents (4-vinylpyridine, iodoacetamide, acrylamide). Cysteine alkylation was also used as a tool for the identification of cysteine-containing peptides. Using a 1:1 mixture of unlabeled acrylamide and deuterium-labeled acrylamide ([2,3,3'-D3]acrylamide), the proteins of interest were alkylated prior to electrophoretic separation. Peptide mixtures produced by trypsin digestion of the resulting protein bands were analyzed by MALDI-TOF MS, and the cysteine content of the peptides was inferred from the isotopic distributions. The cysteine content information was readily obtained and used to improve the protein identification process.