ウシ膵臓リボヌクレアーゼにおける展開領域の修正と、熱安定性とタンパク質分解断片化への影響

リボヌクレアーゼ（RNase）Aおよびより安定したグリコシル化RNase Bは、ASN34に付着した炭水化物部分（GLCNAC2MAN5-9）によって異なります。前に示したように、両方の酵素の熱変性に現れる最初のタンパク質分解切断部位は、ASN34周辺の構造領域にあります。一方、熱展開に向けた安定化への修飾部分の寄与を、一方でタンパク質分解断片化、一方では、グリコシダーゼと（GlcNAC）2MAN3-ラナゼを取得し、cancanavalin aまたはcancanavarinに拡張するために、グリコシダーゼで治療することにより、RNase Bの炭水化物鎖を短縮しました。結果は、RNase Aと比較してGLCNAC-RNaseの熱展開定数と遷移温度の塩性の増加を示していますが、他のRNase種のASN34での修飾の拡張は、熱安定性をさらに高めることはありません。したがって、RNase AとRNase B誘導体の安定性の差は、最初の炭水化物単位に起因します。対照的に、改変部分の体積が増加すると、タンパク質分解の速度は徐々に減少します。一次切断断片の分析から結論付けたように、主な分解経路は、シールド効果の増加により、ASN34-LEU35からThr45-PHE46ペプチド結合にシフトされます。

Ribonuclease (RNase) A and the more stable glycosylated RNase B differ by a carbohydrate moiety (GlcNAc2Man5-9) attached to Asn34. As previously shown, the first proteolytic cleavage sites to appear on thermal denaturation of both enzymes are in the structural region around Asn34. To discriminate the contribution of the modifying moiety to the stabilization toward thermal unfolding, on the one hand, and proteolytic fragmentation, on the other hand, the carbohydrate chain of RNase B was shortened by treatment with glycosidases to obtain GlcNAc-RNase and (GlcNAc)2Man3 -RNase and extended by binding to concanavalin A or concanavalin A-agarose. The results show a saltatory increase of the thermal unfolding constants and transition temperatures of GlcNAc-RNase in comparison to RNase A, whereas the extension of the modification at Asn34 in the other RNase species does not further increase thermal stability. Therefore, the stability difference between RNase A and RNase B derivatives is attributed to the first carbohydrate unit. In contrast, the rate of proteolysis decreases gradually with increasing volume of the modifying moiety. As concluded from the analysis of the primary cleavage fragments, the main degradation pathway is shifted from the Asn34-Leu35 to the Thr45-Phe46 peptide bond due to increasing shielding effects.